Hensikt
Prosedyre for farging av preparat med Grams fargemetode. Denne metoden skiller Gram positive (blå) og Gram negative (rød) bakterier ved mikroskopering.
Omfang
Alle ansatte som er opplært til å farge grampreparat.
Arbeidsbeskrivelse
ANSVAR
Fagbioingeniør, som er tillagt denne analysegruppen, har ansvar for vedlikehold av denne prosedyren.
PRODUKTETS KVALITET- og SIKKERHETSKRAV
Reagensene er CE- og IVD-godkjent.
For reagenser se EcoOnline for sikkerhetsdatablad
ARBEIDETS GANG
Prøvemateriale
Metoden kan brukes til gramfarging av ulike biologiske materialer.
Reagens og klargjøring av disse
Reagensflasker står i sluse med avfallsvask.
Fargeløsningene er klare for bruk og trenger ikke filtreres.
Reagens 1: Crystal violett solution
Reagens 2: Lugol’s solution, stabilized (Jod)
Reagens 3 og 4: Decolorizing solution
Reagens 5: Safranine solution
Feilkilder og interferens
Fargenedslag/artefakter. Vurder preparatet på flere stedet på objektglasset. Reagensrester fra en gammel flaske skal ikke helles over i en ny flaske. Dette kan føre til oppsamling av rester på objektglassene, og kan være en kilde til kontaminering.
Behandling med antibiotika kan gjøre grampositive bakterier mer mottakelig for avfarging.
Hvis prøven inneholder en lav konsentrasjon av mikroorganismer, kan en direkte undersøkelse være negativ.
Avfargingstrinnet er et kritisk steg i fargeprosessen. Det er viktig å benytte eksakt tid oppgitt i tabellen for å unngå falske negative resultat.
Oppbevaring av fargeløsninger under 15°C kan forårsake presipitater. Plasser i så fall flasken i varmebad ca. 60°C i 2-3 timer.
Fremgangsmåte/Utførelse av analysen
§ Lufttørk preparatet og flammefikser ved å føre preparatet gjennom øverste del av flammen 3 ganger.
§ Skru på avtrekk og sørg for at spjeld er åpent.
§ Benytt engangspipetter for å overføre fargeløsning til preparatene. Benytt hansker og la vann fra springen renne under hele prosessen.
§ Plasser preparatene på metallist over vasken og følg tabellen under
|
Fremgangsmåte |
Virketid |
|
Dekk preparatet med Reagens 1: Crystal violet solution |
1 minutt |
|
Rens kort med Reagens 2: Lugol’s solution |
|
|
Dekk preparatet med Reagens 2: Lugol’s solution |
1 minutt |
|
Skyll forsiktig med destillert vann |
5 sekunder |
|
Dekk preparatet med Reagens 3 eller 4: decolorizing solution. Vipp på preparatet inntil det ikke forsvinner mer blått og materialet får en gråblå farge |
10-15 sekunder |
|
Skyll forsiktig med destillert vann |
5 sekunder |
|
Dekk preparatet fullstendig med med Reagens 5: Safranin solution |
1 minutt |
|
Skyll forsiktig med destillert vann |
5 sekunder |
§ Tørk preparatene forsiktig med linsepapir eller la de lufttørke ved romtemperatur
§ Fargene er stabile i flere måneder ved montering av dekkglass
§ Uten dekkglass er fargene stabile i 3 dager.
§ Dersom preparatene er tilsatt olje er fargene stabile i ca. 3 timer.
