Nitrocefin-oppløsningen bestilles fra substratlab. St. Olavs Hospital. Glassene er merket med produksjonsdato og frosset etter tillaging. Sendes nytint og har en holdbarhet på 1 mnd. i kjøleskap. Oppløsningen skal ha romtemperatur før bruk.
Metoden for påvisning av betalaktamaseproduksjon er avhengig av bakterietype og ikke prøvemateriale.
Nitrocefinmetoden:
Nitrocefin er et kromogent cefalosporin. Nitrocefinløsningen er gul/orange men vil, hvis betalaktamringen hydrolyseres, få fargeomslag til mørkrød. Nitrocefinmetoden kan brukes på fast eller i flytende medium.
Flytende medium:
Ha noen dråper av nitrocefin oppløsning i to tynne rør.
Rør 1: Positiv kontroll: Noen kolonier Haemophilus influenzae CCUG 23969
Rør 2: Materiale tatt fra resistensskål i hemmingssonen rundt et betalaktamase stabilt penicillin ( oxacillin). Dette øker muligheten for å påvise induserbar betalaktamase.
Ved kraftig betalaktamase produksjon kommer fargeomslaget raskt (f.eks.hos H. influenzae og M. catarrhalis).
Hos andre arter er reaksjonen langsommere og man bør vente 1 time før avlesning.
Positiv kontroll settes opp de gangene vi har pas.prøve- maks en gang om dagen.
Fast medium:
En kan også dryppe 1 dr. nitrocefin direkte på resistensskåla
Positiv test: Fargeomslag fra gul/orange til mørkrødt.
Hvis det er noe som ikke stemmer ved resultatet av nitrocefintesten, skal det utføres kløverbladtest.
Positiv test: Fargeomslag fra gul/orange til mørkrødt.
Haemophilus infleuenzae, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhoeae og alle i HACEK- organismer: Nitrocefinmetoden
Bedømmelse av sonekant
Lappediffusjon med penicillinlapp og bedømning av sonekanten er en enkel og god metode for påvisning av betalaktamaseproduksjon, spesielt for S. aureus. Hvis isolatet danner betalaktamase er hemningssonen skarpt avgrenset med fullt utviklede kolonier i randsonen og eventuelt i selve sonen. Hos betalaktamase negative isolater avtar kolonistørrelsen i randsonen gradvis innover i hemningssonen ("diffus", "strandbred"). Vekstmønsteret er viktigere å bedømme enn sonens størrelse. Et isolat med skarp sonekant skal rapporteres som resistent mot betalaktamasefølsomme penicilliner uansett sonestørrelse. Isolater som har sonestørrelse < 26 mm besvares som R uansett sonekantens utseende.
NordicAST anbefaler bedømmelse av sonekant og/eller kløverbladtest for påvisning av betalaktamase hos S. aureus.
For koagulase negative stafylokokker har samtlige fenotypiske tester lav sensitivitet og spesifisitet. Rutinemessig testing av koagulase negative stafylokokker anbefales derfor ikke og rapportering av følsomhetskategori for betalaktamasefølsomme pencilliner frarådes. Unntakene er S. lugdunensis (benzylpenicillin) og S. saprophyticus (ampicillin) hvor det er etablert kliniske brytningspunkter for følsomhetskategorisering.
Staphylococcus aureus:
|
betalaktamase |
avlest antibiotikalapp |
sonekant |
svar utgi antibiotika |
|
Positiv |
penicillin:R |
|
penicillin:R |
|
|
penicillin:S |
skarp, avgrenset |
penicillin:R |
|
Negativ |
penicillin:S |
diffus , «strandbred» |
penicillin:S |
Ved tvil sett opp kløverbladtest. Dette er referanse metoden. Kløverbladtest, benyttes som konfirmasjonstest for invasive isolater når stammen er avlest som negativ ved bedømmelse av sonekant (konf. lege).
Staphylococcus lugdunensis
Påvisning av betalaktamaseproduksjon gjøres på grunnlag av:
Moraxella catarrhalis
M.catarrhalis danner vanligvis (> 90 %) betalaktamase. Betalaktamasetesting er ikke indisert. Følgende kommentar tas med i SBUS:
MOBL: M. catarrhalis er vanligvis betalaktamasedannende.
M. catarrhalis svares ut som R mot penicilliner uten mer testing.
Kløverbladmetoden
Ved kløverbladmetoden brukes en Staf. aureus stamme som er følsom for benzylpenicillin (indikatorstammen) . En suspensjon av indikatorstammen spres over mediet (flyt-eller penselmetoden). Bruk egnet medium for bakterien som skal testes.
Når agarflaten er tørr, spres teststammen ut i to tykke streker i et kryss. En benzylpenicillin tablett legges der strekene krysser hverandre og skålen inkuberes 16-18 t ved 35±20C i egnet atmosfære.
Dersom teststammen produserer betalaktamase, vil penicillin som er diffundert ut i mediet, bli inaktivert av enzymet nær veksten av teststammen. Indikatorstammen (her Staf. aureus) vil derfor kunne vokse langs teststammen inn mot penicillintabletten. Det vil dannes et karakteristisk mønster av veksthemming i form som et kløverblad.
• Indikatorstamme: CCUG 17621 S.aureus
• Negativ kontroll: CCUG 17621 S.aureus
• Positiv kontroll: CCUG 15915 S.aureus
Kløverbladmetoden kan brukes som en alternativ metode ved undersøkelse av betalaktamaseproduksjon hos N. gonorrhoeae og H.influenzae. Den kan også brukes som en alternativ metode for HACEK-gruppen.
Tabell. Oppsummering av mikrobespesifikke anbefalinger.
|
Mikrobe |
Nitrocefin |
Sonekant |
Kløverblad |
|
Staphylococcus aureus |
+ (a) |
++ |
++ |
|
Koagulase negative stafylokokker (b) |
- |
- |
- |
|
Haemophilus influenzae |
++ |
- |
++ |
|
Moraxella catarrhalis (c) |
++ |
- |
IE |
|
Neisseria gonorrhoeae |
++ |
- |
++ |
|
Neisseria meningitidis |
++ |
- |
IE |
|
Enterococcus faecalis (c) |
++ |
- |
IE |
++ Anbefalt metode + Alternativ metode - Anbefales ikke IE Dokumentasjon mangler
(a) Kun positivt resultat kan tillegges vekt (b) Testing frarådes (c) Testes ikke rutinemessig