Hensikt

Sikre korrekt analysering og vurdering av prøvesvar på Sebia Capillarys 3 Tera ved Avdeling for Laboratoriemedisin (ALM), Sykehuset Levanger.

Omfang

Gjelder alle som er godkjent for å analysere prøver på Sebia Capillarys 3 Tera

Grunnlagsinformasjon

HISTORIKK

Proteinelektroforese har vært utført med Beckmans Paragon Elektroforesesystem siden 1990.

Sebia Capillarys 2 ble tatt i bruk 1. september 2007. Et helautomatisk instrument som utfører kapillær elektroforese og immunotyping. Den har 8 kapillærer som separerer seks proteinfraksjoner i serum og fem i urin.

Sebia Capillarys 3 Tera ble tatt i bruk uke 26, 2019. Den har 12 kapillærer.

ANALYSEPRINSIPP OG TERMINOLOGI

Serumprøven løses i en buffer som er spesifikk for proteinelektroforese. Ved hjelp av elektrisk spenning trekkes prøven i en elektro-osmotic-flow gjennom et kapillær. Proteinene i prøven vandrer med ulik hastighet avhengig av deres elektriske ladning og størrelse. Ved elektroforese migrerer alle proteinene fra anoden til katoden og detekteres ved 200nm. Resultatet skrives ut som en kurve, hvor den enkelte proteinfraksjon danner en topp på kurven. Topparealet er avhengig av mengde protein. I hver fraksjon er det ett eller flere proteiner. Kapillærelektroforese skiller mellom disse proteinfraksjoner; albumin, alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 og gamma i serum og albumin, alfa1, alfa2, beta og gamma i urin.

Urinprøver:
Urinprøver konsentreres og dialyseres i en buffer som er spesifikk for proteinelektroforese.

Urinprøver analyseres etter samme prinsipp som serumprøver og blir fraksjonert i 5 fraksjoner, albumin, alfa-1, alfa-2, beta og gamma. Det benyttes samme buffer som til serumproteiner og immunotyping.

Immuntyping:
Det benyttes antistoff mot IgG, IgA, IgM, kappa og lambda. Vi vil se frafall av aktuell komponent ved patologiske funn.

MEDISINSK INDIKASJON

Serum

Mistanke om myelomatose og Waldenstrøms sykdom. Kontroll av pasienter med kjent forekomst av monoklonale komponenter bestående av intakt immunglobulin. Undersøkelsen er dårlig egnet til å påvise non-sekretorisk myelomatose og lett-kjede-myelomatose, hvor kvantitering av frie, lette immunglogulinkjeder i serum er en bedre undersøkelse. Lett-kjede-myelomatose kan også påvises med urin-proteinelektroforese.

Utredning av høy SR.

Urin

Mistanke om Bence Jones proteinuri (monoklonale, frie, lette immunglobulinkjeder). Brukes for å stille diagnosen lett-kjede-myelomatose. Kvantitering av frie, lette immunglobulinkjeder i serum er et bra alternativ til urin-proteinelektroforese for diagnostikk og kontroll av lett-kjede-myelomatose.

STANDARDER/KALIBRATORER

Det normale kontrollserumet er utviklet for normalisering av kapillærer og migrasjonskontroll av humane proteiner. Kjøres før start av en ny analysesekvens.

Løs 2 flasker i 1.0 ml dest vann. Etter henstand på benk blandes materialet godt og overføres til et rør. Merkes med barkodeetikett som følger med og plasseres i kontroll rack (0).

Ved analysering av uriner fortynnes 25 ul nomalkontroll med 2,0 ml buffer før analysering. Merkes med normalkontroll etikett og kjøres i kontrollrack(0).

INTERN KVALITETSKONTROLL

Seronorm Immunoprotein L1 og L2 Frosset humant materiale. Lagres i -80 grader.
Tines i ca 30 min på vippe og blandes godt. Overføres plastrør og merkes med barcodeetikett Elfo SN L1/Elfo SN L2.

IT-kontroll: M-komponent kontroll som inneholder en serumpool med 3 M-komponenter. Den løses opp i 1,0 ml dest vann. Etter henstand blandes materialet, fordeles i tre nuncrør og merkes med barkodeetikkett som følger med. To av glassene fryse i -20 grader. Kontrollen har lang holdbarhet i kjøleskap, den brukes flere ganger. Ved analysering velges immunotypin 6-mode og prøven settes i prøverack. Den analyseres en gang i måneden eller ved nytt IT reagens. Ta utskrift av IT-kurven, vurder den og sett den i egen perm.

EKSTERN KVALITETSKONTROLL

Deltakelse i Labquality fra juni 2007, to utsendinger pr år.

Viser til prosedyre; ALM-; Håndtering og vurdering av sammenlignende laboratorieprøvinger (SLP)/ ekstern kvalitetesikring og handtering.

Arbeidsbeskrivelse

ANSVAR

Fagbioingeniør har ansvar for at prosedyren er oppdatert. Fagbioingeniør og spesialbioingeniør er ansvarlig for at instrumentet fungerer og for opplæring. Alle som har elektroforese som arbeidsoppgave er ansvarlig for å gjøre seg kjent med og følge prosedyren etter opplæring. Fagbioingeniør har ansvar for at prosedyren er oppdatert.

ARBEIDETS GANG

Prøvemateriale

Holdbarhet:

Serum: 10 dager i kjøleskap og 1mnd. i -20 grader fryser (fryses innen 8t etter den er tatt).

Urin: 1 uke i kjøleskap og 1mnd. frosset. Lagring utover 1 uke må skje ved -70 grader.
Det benyttes morgenurin eller samleurin. Spoturin utføres ikke.

Prøvematerialet bør ikke være hemolysert, det induserer en dobbel alfa2-sone. Plasma kan ikke benyttes, da fibrinogen migrerer i beta2 fraksjon (skulder til beta 2).

Gammelt serum som ikke er oppbevart etter forskriftene, vil beta2 fraksjon være modifisert.

Røntgenkontrastmiddel: Prøvene må tas før pasienten får infusjon av røntgenkontrastmiddel. Kontrastmiddelet kan f eks vises i enden av alfa2 faksjon.

Reagenser og klargjøring av disse

Nederste hylle er Vann og Vaskeløsning. «Waste» til venstre er ikke aktiv – avfall sendes til dunk under benken. Sjekkes visuelt og tømmes ved behov.

Vaskeløsning: Inneholder 75 ml konsentrert løsning som tilsettes destillert vann til 750 ml. Bytt til nytt filter, bruk hansker.

Proteinbuffer er ferdig til bruk. Bytt filter når ny flaske tas ibruk, benytt hansker.

Alle reagenser er merket med RFID kode; lotnummer og utløpsdato registreres automatisk

 

 

 

 

 

«Secondary reagent compartment»: De står i ei «kjøle blokk»

Capiclean settes i for ukentlig vask, klar til bruk. Settes i posisjon S1

IT-reagens og diluent-IT, reagens til 60 tester: Holdbart 60 dager på Cap3 (3 mnd for vårt vedkommende når  vi setter reagensene i kjøleskap hver helg), uåpnet til utgangsdato.

IT-reagenset består av 6 flasker på 1,2 ml.

gul	bufferløsning
rosa	anti IgG
mørkeblå	anti IgA
gulgrønn	anti IgM
lyse grønn	anti kappa
lyseblå	anti lambda

For diluent-IT byttes korken på flaska med medsendt perforeringskork før det settes i posisjon S2 (eller S3/S4).

IT-reagens/Diluent og Capiclean må tas ut når instrumentet slås av, settes da i kjøleskapet.

Posisjon T2: benyttes til vaskeløsning for proben, Hypoklorittfortynning: 0,5 ml hypokloritt (14%)+ 2,0 ml destvann

Til prefortynning av urin:
Dialysebuffer: Inneholder 480ml konsentrert løsning som tilsettes destillert vann til 960 ml, benytt målesylinder, fordel den så på to flasker som merkes med utløpsdato/lot/sign.

Vedlikehold:

Ukentlig vedlikehold utføres på mandag, da er instrumentet programert til å utføre hypokloritt-og Capiclean vask. Instrumentet er avslått i helgen og IT-reagens/Dil. IT/Capiclean står da i kjøleskapet. Ved innsetting av reagens lages det ei hypoklorittløsning til hypoklorittvasken. Settes i posisjon T2.
Disse prosessene kan også startes manuelt via Maintenance&Cleaning.

Vannbeholdere skylles og fylles med dest vann hver dag før kjøring.

Bytting av filter på vanndunken gjøres hver mandag, benytt hansker

Avslutte og slå av instrumentet før helg, utfør alltid en shutdown før instrumentet slås av (skjermen er grå uten lys når shutdown er ferdig).
Det må gjøres vurdering om å slå av dersom instrumentet blir stående flere dager uten analysering. Kapillærene tåler maks 5 døgn uten oppstart.

Analyseutstyr og klargjøring av disse

Oppstart

1. Slå på instrumentet hvis det har vært avslått og slå på PC’en. Gjelder i hovedsak etter helg.
   Trykk «Start» når instrumentet er ferdig med initialiseringen. Utfør reagenssjekk og påfylling av vann før «Start». Juster nivået på reagenset. Se pkt 5 og 6
2. Slå på PC'en om den har vært slått av. Logg på (Passord: sebia). Passordet ved pålogging av programmet: cap. Når kommunikasjonen er ok, viser instrumentet «Waiting for rack».
3. Øvrige ukedager og instrumentet står på og vi har valgt av automatisk oppstart til gitt tidspunkt (kl 07), da vil det være klart direkte etterpå («Waiting for rack»). Analysering av normalkontroll kan utføres.
4. Pass på at instrumentet er i rett analysemodus. Analysebytte under analysering kan gjøres ved metoderack.
5. Sjekk reagensstaus og sett på nytt om nødvendig. Se pkt 6 for å åpne til reagensavdeling.
6. Vannbeholderen tømmes og fylles hverdag. Benytt ionebyttet vann. Trykk på knapp nede på skjermen for å få åpne lokket.
   Vent til det høres et klikk for at låsen er åpen før du løfter lokket og tar ut vannflaska.

 

	Grønt lys betyr at det er tilstrekkelig reagenser
	Orange/gult lys betyr at det snart blir tomt. Sett på nødvendige reagenser og vann i rett posisjon.
	Rødt lys betyr at det mangler reagenser, fall må tømmes eller vedlikehold må utføres.

 

7. Sjekk reagenskopper (kyvetter) og etterfyll hvis nødvendig (en melding vil vises hvis det mangler reagenskopper). Plass til 2x14 kopper
8. Tøm fast avfall ved oppstart, bytt avfallsbeholder i skuffen hvis nødvendig. Melding ved 28 stk brukte kopper. 10 sekunder etter at skuffen åpnes vil nedtellingen nullstilles automatisk.

Kan også nullstilles manuelt via «Reset counter» under «Disposable and waste»

Analysering serumprøver

1.    Serumkontroll (normalkontroll)med barkode settes i posisjon 1 i rack 0 - uten kork

2.    Sett 8 prøverør med synlig barkode i hvert rack - uten kork (75-100mm høye)

3.    Åpne døren for å sette på et eller flere rack. Det er plass til 15 rack totalt. «Sampler» stopper når døren åpnes for å sette på rack.

4.    Etter analysering tas rackene ut på venstre side.

5.    Sjekk kurvene ved å velge «Curve mosaic» på oppgavelinjen

6.    Dersom IT må utføres velges IT request og velg fortynning.

Standard: hvis det totale nivået av immunglobuliner utgjør mellom 8 og 20 g/l

Hypergamma: hvis det totale nivået av immunglobuliner er > 20 g/l

Hypogamma: hvis det totale nivået av immunglobuliner er < 8 g/l

 

Analysering urinprøver

1. Urinprøven, minimum 5 ml urin, sentrifugeres i 10 min før videre forbehandling.

2. U-elektroforese utføres ikke på uriner med u-prot < 0,07 g/L.
Benytt analysekommentaren; ELFU2, Urin elektroforese utføres ikke ved u-prot ≤ 0,07g/L.

3. Urinen må forbehandles i to trinn, konsentrering og dialysering.

Til denne prosessen benyttes dialyserør/kopper; ”CAPILLARYS dialysis system”.

Forhold mellom mengde urin og vann avhenger av totalproteinkonsentrasjonen i urinen.

under 1g/l	2 ml urin og 18 ml deionisert vann
mellom 1 og 3 g/l	0,5 ml urin og 19,5 ml deionisert vann
over 3g/l	Urinen prefortynnes til 3 g/l med deionisert vann Prefortynning: Eksempel Fortynninga skal være: 3 g/l Totalt volum:5 ml uprot x volum (X) i ml = 3 X 5 Volum = 15 /uprot Pipetter X ml og fyll opp med deionisert vann til 5 ml
	Bland så 0,5 ml fortynnet urin og 19,5 ml deionisert vann Holbarheten: Må analyseres innen 1 dag.

4. Ekvillibrer rørene til likevekt med deionisert vann og sentrifuger i 40 min, ca. 4000g (sentrifuga vår går ikke så høyt, men det er ok hastighet den vi får til, ca 4000 omdr)

5. Etter sentrifugering tilsettes 20 ml bruksløsning av dialysebuffer i hvert rør. Sentrifuger i 40 min, ca 4000g.

6. Sjekk om det ligger prøvemateriale oppe på den flate sonen i dialyserøret. Dersom det er tilfelle brukes en mikropipette for å få dette ned i brønnen. Dersom volumet er mindre enn 0,5 ml, tilsettes bruksløsning av dialysebuffer til endelig volum 0,5 ml.

7. Bland prøven med pasteurpipette og overfør til plastrør.

8. Velg URIN på Sebia ved metoderack.

9. Normalkontrollen må fortynnes før urin analysering: 25 ul normalkontroll + 2 ml dialysebuffer.

10. Kjør kontroll og vurder kurvene i «Curve mosaic»

11. Analyseres urinene når kontrollen er ok.

Besvarelse og oppfølging av svar:

Før vi analyserer prøvene kan det være nyttig å lage en batchliste som vi kan benytte som arbeidsliste. Urinprøver analyseres direkte uten batchliste fordi det vanligvis er få prøver.

Når barkodene er lest og analysert på Cap3 overføres kun «ID», resten av informasjon må hentes inn fra Beaker via «HOST». Da går proteinsvaret over til Cap3.

Pga. ulikhet i overføring av persondata fra Beaker i forold til tidligere NSL er det mange pasienter som ikke kommer opp med historikk. For å se om de har historikk må vi søke de opp via « Search for patient history» eller benytt historikken i Beaker.

Prøvene besvares manuelt via uteståendelisten

Elektroforesen besvares med «UTFØRT», det skal legges til en kommentar. Flere av kommentarene ligger som « Mnemonikk» eller SmartText.

Kurver uten patologiske funn besvares med Mnemonikk ELF4

Dersom det er vanskelig å vurdere elektroforesemønsteret kan det hjelpe å legge over normalkurven. Det må tas hensyn til tidligere resultat, vurderes opp mot frie lette kjeder og benytt resultatgjennomgang i Beaker. Dersom det blir vanskelig å vurdere elektroforesemønsteret bestilles Immuntyping (IT).

Ved patologisk funn og behov for rekvirering av Immuntyping benyttes de respektive knappene i verktøylinja  og f eks  etter utført typing.

 

Kvantitering av M-konponent gjøres ved å velge «Peak topp»,  benytt IT plottet for å velge hvordan en «legger» kvantiteringen av komponenten. Ved å velge «peak topp» blir polyklonal bakgrunn eliminert.

Det kan forekomme at det passer bedre å benytte «peak hel», når to monoklonale komponenter ligger inntil hverandre, det er viktig at den samme målingen benyttes hver gang slik at resultatet kan vurderes over tid.

Immunfiksering til SOH bestilles dersom det blir vanskelig å konkludere. Da bestilles immunfiksering på verktøylinja, vi skanner inn elektroforese- og IT-kurven i Beaker før prøven sendes.

Monoklonal komponent av frie lette kjeder som er synlig i s-elektroforesen kvantiteres ikke på Capillarys, det utføres på Atellica Neph 630.

Frie lette kjeder som påvises i u-elektroforese kvantiteres med «Peak topp». Konsentrasjon skal beregnes med den korresponderende konserasjon i prosent som kommer opp:

Utregning av komponent i urin: g/l

Hypogammaglobulinemi: Når gammafraksjon viser < 6,0 hos pasienter uten kjent M-komponent, besvares med Mnemonikk ELF2.

Immunologisk kreftbehandling av myelomatose pasienter: Den behandlingen inneholder immunglobulin (IgG kappa/lambda), og den kan vises i gammafraksjon i små mengder. Den skal ikke besvares ut, men vurderes hver gang, skal se etter endringer som kan være et nytt funn.

Dersom vi påviser en monoklonal komponent i spormengde, besvares den med kommentar: «Monoklonal komponent påvist, type ……, i spormengde.» 

Monoklonale komponenten rekvireres da ikke.

Kjent M-komponent:

Den aktuelle monoklonale komponenten rekvireres via verktøylinjen.

Svar under 0,5 gis ut som < 0,5 g/l

Dersom pasienten har kjent monoklonal komponent, men er ikke målbar idagens prøve, skal den rekvireres og besvares i svarfeltet som: «0,0». Elektroforesen besvares med: "Pasienten har kjent monoklonal komponent av type….., den er ikke synlig i dagens prøve"

Før verifisering av svaret må det kontrolleres at det jobbes med riktig pasient. Sjekk historikken i Beaker og at riktig M-komponent er bestilt, kontroller at du har samme prøve oppe på Cap3 og i  Beaker, ved å kontrollere f.eks beholder ID. Når alt er kontrollert verifiseres svarene.

Svaret på de med nyoppdaget M-komponent eller som er vanskelig å tolke, skal IT-svaret vurderes i tillegg av en fagansvarlig på elektroforese, dette for å avdekke evt. feilvurderinger.