ALM-MM-Fæces: ESBL Screening v. 1.10

Arbeidsbeskrivelse

Ekstern kvalitetskontroll

Med. mikrobiologi er med i SLP/ringtestprogrammet til Folkehelseinstituttet og

NEQAS.

Intern kvalitetskontroll

Kontrollstammer:	Egenskap	Chrom egenskap	ESBL plate(hel)	CARBA (Bi-plate)	OXA48(Bi-plate)
ESCO ATCC 25922	Negativ	IV	IV	Ikke aktuell	Ikke aktuell
KLPP ATCC 700603	ESBL_A positiv	Blå til blågrønne kolonier	Vekst	IV	IV
KLPP ATCC BAA-2524	OXA-48	Blå-Grønne/Turkis kolonier	Ikke aktuell	Vekst	Vekst

ESCO: Escherichia coli.

KLPP: Klebsiella pneumoniae.

Bilde 1.0 Viser hvordan kontrollstammer skal benyttes (Kontrollstammene ESCO ATCC 25922 og KLPP ATCC 700603 skal ikke vokse på henholdsvis ESBL-, og CARBA/OXA-plate men en kan av og til se et fargeomslag i agar som ikke defineres som vekst).

Bilde 1.0

Viser Kontroller utsæd på skåler fra Biomerieux

Ansvar

Fagbioingeniør faggruppe II har ansvar for vedlikehold av denne prosedyren. Alle som er opplært i denne prosedyren har ansvar for å følge prosedyren.

HMS/sikkerhetsinformasjon

Benytt hansker ved utpakking og utsåing av prøver. Såes ut i avtrekksskap. Etterarbeid kan utføres på benk. Alt av utstyr som benyttes til ESBL-screening skal kastes i risikoavfall.

Arbeidets gang

Prøvematerialet og bearbeidelse av dette

Anbefalt prøvemateriale for screening av ESBL er penselprøve fra rektum copan-eSwab med hvit topp (prøver på rød-topp, for virus u.s. kan ikke benyttes). Eventuelt kan andre materialer også screenes dersom det er relevant. Alle prøver (unntak: urinprøver) hvor det er presisert at det ønskes ESBL us. skal screenes i tillegg til evt. dyrkning.

Dersom prøven skal benyttes til flere undersøkelser bør det deponeres på skåler uten tilsatt antibiotika før det deponeres på screening-agarer som er tilsatt antibiotika.

For Urinprøver:

v Kateterurin fra pasienter med permanent kateter skal screenes. Hvis kun kateterurin er mottatt og ESBL screening er negativt, legg til kommentar RPES (=Rektal penselprøve anbefales for screening av ESBL-status).

NB: Merk at VRE screening skal gjøres rutinemessig på alle ESBL dersom det ikke opprinnelig er bestilt fra rekvirent.

Unntak: Ingen VRE screening ved opplysning om ESBL-kontroll/kjent ESBL.

Prøver oppbevares i kjøleskap inntil forsendelse.

Prøvemateriale tatt på Copan eSwab (transportmedium) kan oppbevares og analyseres innen 48 timer (gjelder for rom.temp og 4-8°C). Prøver med transporttid over 48 timer skal allikevel såes ut. Ingen kommentar skal ut til rekvirent.

Skålene er holdbare i 4 uker (Holdbarhetsdato står på eskene fra leverandør).

Analyseutstyr og klargjøring av disse

Skålene oppbevares på kjølerommet i originalemballasjen (kjølerom K1). Skålene romtempereres før bruk.

Det anbefales fra produsent at skålene lysskjermes, da lyseksponering, kan hemme kromegenskaper i mediet. Skålene dekkes derfor til med et mørkt trekk (sorte småe poser) eller oppbevares i lukkende esker før bruk.

Feilkilder og interferens

v Kjøres ikke på WASP.

v Lyseksponering, kan hemme kromegenskaper i mediet.

v Enkelte multiresistente mikroorganismer (andre enn CPE) kan utvikle seg på CARB-mediet og produsere kolonier med en karakteristisk farge. Se under relatert pakningsvedlegg for disse mediene for utfyllende feilkilder og interferens.

v Produsent skriver i metodens begrensninger at Pseudomonas aeruginosa kan vokse på ChromID™ ESBL agar (ESBL) som fargeløse kolonier.

v Det er flere bakterier som kan vokse som farveløse koloniner, derfor SKAL all suspekt oppvekst sjekkes ut.

v Andre Gram negative og Gram positive stammer skal stort sett inhiberes. Det samme gjelder for gjærsopp.

v Følsomhetsbestemmelse skal ikke gjøres på oppvekst fra selektive medeier.

v Må inkuberes aerobt uten syre (C0₂) da syre kan forskyve pH balansen i mediet og dermed forringe chromegenskaper.

Fremgangsmåte/Utførelse av analysen

Agar SKAL ha romtemperatur før bruk. Og være tørre før de benyttes. Tørk av fukt i lokket før bruk.

Prøven såes ut i avtrekksskapet. Benytt hansker (kjøres ikke på WASP).

Benytt kun en prøve pr plate.

Vortex prøve før utsåing.

Bruk sterilpipette til å avsette 1 dråpe prøvemateriale i første kvadrant på respektive medier. Så deretter ut med blå-øse. Skift øse for hver agar og hvert kammer.

v 1 stk Urin-agar (for adekvat tatt prøve)

v MacConkey-agar.

v 1 stkChromID™ ESBL agar (ESBL)

v 1 stk ChromID CARBA SMART- agar (ESBL/OXA) (biplate)

Skålene skal inkuberes tildekket med lokket ned ved 36°C (inkubator i10) i 18-28 timer (ideelt 20-22 timer). Når fargene (ved oppvekst) på koloniene er dannet er det tillat å eksponere for lys.

Utsåing av kontrollstammer:

Kontroller:

v Kontrollstammer tilsettes i copan E-swab, kontrollene kan benyttes i en uke etter at de er tilsatt i copan E-swab.

v Benytt 1 agar for hver kontrollstamme.

v Vortex prøve før utsåing.

v Bruk sterilpipette til å avsette 1 dråpe prøvemateriale i første kvadrant på respektive medier.

v Så deretter ut med blå-øse. Skift øse mellom hvert utsæd.

v Kontrollstammer skal ikke såes ut på urin-agar/MacConkey agar.

Vekstkontroll av kontrollstammer skal føres her: Vekstkontroll ESBL

i fanen for ESBL og VRE kontroll.

Vurdering

Differensiering og/eller identifikasjon av isolatene gjøres på grunnlag av kolonienes farge og utseende.

For ChromID™ ESBL agar (ESBL):

(Rosa kolonier, ESCO ESBLA,, Grønne kolonier: KLPN ESBLA)

Lyserøde til burgunderfargede kolonier, eller gjennomsiktige med et lyserødt til burgunderfarget sentrum: E. coli.
Grønne, brunlig grønne og blå kolonier: KESC-gruppen.

Mørkebrune til lysebrune kolonier eller bakterievekst: Proteeae-stamme.

Farveløse kolonier: sannsynligvis Pseudomonas sp.

NB: Visse Pseudomonas stammer kan produsere brun pigmentering. Oxidase-testen gjør at de kan skilles fra Proteeae.

For ChromID CARBA SMART- agar (ESBL/OXA) (biplate):

(Rosa kolonier: ESCO CPE, Grønne kolonier: KPC)

Rosa til burgunder eller gjennomsiktige kolonier som er rosa til burgunder I midten: E. coli

Blågrønne til blågrå eller lilla kolonier: KESC-gruppen.

Tolkning av oppvekst:

Relevant oppvekst spres på MacConkey-agar før oppsett av følsomhetsbestemmelse.

Følsomhetsbestemmelse skal ikke utføres direkte fra kromogene medier, da antibiotika i mediet kan påvirke resultatet. Spredninger gjort tidlig på dagen som umiddelbart settes i inkubator kan gi nok materiale til oppsett av følsomhetsbestemmelse på slutten av dagen.

De kromogene egenskapene til skåla skal bare benyttes til foreløpig identifikasjon av mikroben.

All oppvekst (av Gram negative staver) skal identifiseres med MaldiTof.

All oppvekst skal sjekkes ut med følsomhetsbestemmelse. Uavhengig om lik ID fra vekst på de ulike chrom-agar.

NB: OXA-48-244 E.coli:

Utbrudd av OXA-48-244 E. coli, i Norge, disse stammene utrykker «lavaktivitet» mot karbapenemer, og kan pga dette hemmes i vekst på screening-agar. Derfor skal ALLE Gram negative staver som i tillegg vokser på MacConkey også identifiseres på MaldiTof. Dersom isolatet identifiseres til E.coli skal den settes opp på diskdiffusjon for meropenem og piperacillin-tazobactam.

OXA-48-244 E. coli, kan vokse på ESBL hel agar.

Ved mistanke om ESBL_CARBA konferer ALLTID mikrobiolog. Dersom det ikke er mulig skal fagansvarlig kontaktes.

Enterobacterales og Acinetobacter spp:

Alle funn skal følsomhetsbestemmes med diskdiffusjonsmetode.

Alle NYE funn skal i tillegg settes opp på MIC oppsett for ESBL_A og AmpC

Pseudomonas spp:

Alle funn skal følsomhetsbestemmes med diskdiffusjonsmetode.

Benytt flytskjema fra NordicAST for videre arbeid med funn.

Flytskjemaet finnes i brytningspunkttabell i fanen for Enterobacterales og Pseudomonas spp.

Ved mistanke om ESBL_CARBA spre til sending K-res. Alle mistenkte ESBL_CARBA skal sendes K-res for PCR.

For tolkning av mistenkte ESBL se; ALM-MM-Res; ESBL av Enterobacterales, Pseudomonas sp, Acinetobacter sp

Definisjoner for nytt funn:

ESLB_A / ESBL_M

Inneliggende:

Tidligere positive betraktes som nytt funn hvis > 6 mnd siden forrige ESBL-positive stamme.

Dvs det er ikke nødvendig med konfirmasjonstest (MIC/diskdiffusjon) dersom følsomhetsprofil og artsidentifikasjonen er lik.

Primærhelsetjenesten:

Tidligere positive betraktes som nytt funn hvis > 12 mnd siden forrige ESBL-positive stamme.

Dvs det er ikke nødvendig med konfirmasjonstest (MIC/diskdiffusjon) dersom følsomhetsprofil og artsidentifikasjonen er lik.

ESBL_CARBA:

Konfirmasjonstest utføres (MIC/diskdiffusjon) en gang pr. kalenderår, dersom følsomhetsprofil og artsidentifikasjon er lik.

Ved ESBL_CARBA må man melde nye funn hos samme pasient hvis det er ulik ID fra tidligere.

Det er ikke nødvendig å sende inn repeterte isolater til k-res (samme species og følsomhetsprofil) fra screeningprøve eller klinisk prøvemateriale hvis det tidligere er undersøkt for karbapenemaseproduksjon de siste 12 måneder.

Med mindre spesielle epidemiologiske grunner (eg. opplysning om nylig reise). I så fall konferer lege.

Svarrapportering

Ingen vekst etter 48 timer besvares: Negativ.

Ved funn:

Følsomhetsbestemmelse svares vanligvis ikke ut ved screening. Gjøres evt. i samråd med lege, eller dersom rekvirent etterspør dette.

For svarrapportering, kommentarer, sending og ev ved utgivelse av følsomhetsbestemmelse se: ALM-MM-Res; ESBL av Enterobacterales, Pseudomonas sp, Acinetobacter sp

Hensikt

Sikre riktig påvisning av ESBL-produksjon (ESBLA, ESBLCARBA/ OXA-48) blant isolater av Enterobacterales, Acinetobacter spp. og Pseudomonas aeruginosa.

Omfang

Alle bioingeniører som er opplært til å utføre denne type analysearbeid ved Lab. for med. mikrobiologi.

Grunnlagsinformasjon

Analyseprinsipp og terminologi

ESBL (extended spectrum betalaktamaser) er en gruppe av enzymer som bryter ned betalaktamantibiotika også de bredspektrede. Slik resistens er ofte genetisk koblet til resistens mot andre grupper antibiotika som aminoglykosider (gentamicin, tobramycin), kinoloner (ciprofloxcacin) og trimetoprim-sulfa. Disse resistensmekanismene kan overføres mellom like og ulike bakterier.

ESBL deles inn i 3 hovedgrupper: ESBL_A (klassisk), ESBL_M (plasmidmediert AmpC) og ESBL_CARBA (karbapenemaser).

Korte definisjoner:

v ESBL_A(klassisk ESBL): Bryter ned betalaktamer (opp til og med 4. generasjons cefalosporiner.). Hemmes (som oftest) av klavulansyre. Eksempler på enzymer som er mest vanlige er: CTX-M, SHV, TEM.

v ESBL_M (plasmidmediert AmpC) : AmpC-produksjon hos Enterobacterales kan enten skyldes økt produksjon av kromosomal (derepressert) eller plasmidmediert AmpC (Kromosomal AmpC blir ofte hyperprodusert hos Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Morganella). De fleste Enterobacterales har et lavt uttrykk av en kromosomal AmpC. Unntakene er Klebsiella pneumoniae. og Salmonella spp. som bryter ned betalaktamer opp til og med 3. generasjons cefalosporiner.

v ESBL_CARBA(Karbapenemaser): Bryter som oftest ned alle betalaktamer. Mest vanlige er KPC, VIM, IMP, NDM OG OXA-48 etc.

Dyrkning gjøres på 3 chromogene agens fra BioMerieux: ChromID™ ESBL agar (herettet kalt ESBL) og chromID® CARBA SMART –agar (CARBA/OXA) i tillegg skal det såes ut på en MacConkey-agar og urin agar. (kontroll for adekvat prøvetaking).

Analyseprinsipp for ChromID™ ESBL agar (ESBL):

Skålene er tilsatt diverse antibiotika som muliggjør selektiv vekst av ESBL-produserende enterobakterier. Og av karbapenemaseproduserende enterobakterier (CPE).
Skålene er også tilsatt to kromogene substrater som muliggjør direkte identifikasjon. Se vedlegg 5 REF 43481 (under relatert).

Analyseprinsipp for ChromID CARBA SMART- agar (ESBL/OXA):

Skålene er tilsatt diverse antibiotika som muliggjør selektiv vekst av ESBL-produserende enterobakterier. Skålene er også tilsatt tre kromogene substrater som muliggjør direkte identifikasjon. Denne platen er en biplate. Se vedlegg 5 REF 414685 (under relatert).

Ordforklaringer:

· Adekvat: Helt dekkende eller fullgod, herunder - er prøven tatt fra rektum?*
(unntak av immunsupprimerte).

· Inhibere: Hemme, hindre.

· CPE: Carbapenemase-Produserende Enterobacterales.

· CRE: Carbapenemase Resistente Enterobacterales

· KPC: Klebsiella-pneumoniae-carbapenemaser.

Medisinsk indikasjon

Anbefalinger fra FHI om smitteverntiltak i somatiske sykehus ved bærerskap og infeksjon med ESBL-holdige bakterier.

Ønske fra smittevern ved sykehuset Levanger om påvisning av ESBL-holdige bakterier etter at nasjonale retningslinjer ble oppdatert.

Fra FHI:

Før eller ved innleggelse i sykehus, eller skal inn til behandling, anbefales det å ta prøve for ESBL-holdige bakterier av alle som:

v Er direkte overført fra sykehus utenfor Norden.

v Har vært innlagt i helseinstitusjon utenfor Norden det siste året.

v Det siste året har vært innlagt i helseinstitusjon i Norge eller annet nordisk land der det (under det aktuelle oppholdet) pågikk et utbrudd med ESBL-holdige bakterier.

v Har bodd/bor sammen med person som har fått påvist ESBL-holdige bakterier det siste året.

v Tidligere påvist ESBL-holdige bakterier.

v Ved alle innleggelser i avdelinger som etter lokal vurdering karakteriseres som avdelinger med særlig mottakelige pasienter og/eller stor risiko for spredning, (f.eks. brannskadeavdeling, intensivavdeling, hematologisk avdeling, nyfødtintensiv o.l.) (hentet fra FHI sin hjemmeside).

Se også: ESBL ,VRE og andre resistente mikrober: Screening, prøvetaking og isolering av pasienter med mistenkt eller påvist resistente mikrober.

OXA 244:

Skålene har vært i bruk ved SL siden 2017. Etter utbrudd av denne stammen ble det i 2020 konferert med K-res da det kom tilbakemeldinger om at superCARBA AGAR fra CHROMagar var anbefalt til sikker påvisning av slike stammer. Med bakgrunn i dette ble det vinteren 2020 utført en liten studie ved MM, der stamme påvist i rutinen 2018, samt 3 tilsendte isolater fra K-res med kjent OXA-48-244 E. coli ble testet. Alle stammene vokste på ESBL-agar. 2 av stammene tilsendt fra K-res vokste også på CARB/OXA-agar, men med sparsom vekst. Se; Utprøving vinteren 2020 med OXA-48 E. coli tilsendt fra K-res

Sikker påvisning av alle ulike typer ESBL kan sjelden utføres ved dyrkning på 1 medium. Vår screening innebefatter ALLTID 3 agarer, for å kunne ivareta på best mulig måte påvisning av ulike typer ESBL mekanismer.

Referanser

Hovedreferanse:

1. ESBL veileder for helsepersonell

Tilleggsreferanser:

2. Prosedyrer ved medisinsk mikrobiologi ved UNN versjon 1.2 ID: 25904.

3. Prosedyrer ved medisinsk mikrobiologi SOH EQSID: 19449.

4. Prosedyrer ved medisinsk mikrobiologi SUS EQSID: 19043.

5. Pakningsvedlegg for ChromID™ ESBL agar (ESBL) og chromID® CARBA SMART–agar (CARBA/OXA ) vedlagt som relatert REF 43481 og REF 41685 (bilder av skåler tatt fra Biomerieux ).

6. β-LAKTAMASER (ESBLA, ESBLM & ESBLCARBA) hos gram negative. Nettundervisning mikrobiologi 14.04.16 Ørjan Samuelsen, Forsker.

7. K-res.

8. Verifiseringsrapport for ESBL-agar se EQS ID: 26964

9. copangroup.com (transportmedium).

10. Mulige strategier for påvisning av ESBL-holdige Gram negaticve staver 2015

Forfatter:	Kyriakos Zaragkoulias (Overlege med. mikrobiolog) Carina Williksen (Fagansvarlig bioingeniør)
Godkjent av:	Geir Kvam (Seksjonsleder) Kjetil Landsem (Avdelingssjef)
Dokumentadministrator:	Carina Williksen (Fagansvarlig bioingeniør)
Dokument-ID:	27022
Gyldig fra:	18.02.2025
Revisjonsfrist:	18.02.2026