Arbeidsbeskrivelse

 

INTERN KVALITETSKONTROLL

Kontrolløsninger/referansematerialer

Oppsett gjøres mandag, tirsdag, onsdag, torsdag:

Stammer til kontroll av nøyaktighet og presisjon:

E.coli                                      ATCC  25922 (2 ordinære dispensere +NORM blodkultur + urin stav ekstra midler)

Staphylococcus aureus           ATCC  29213=CCUG 15915 (2 ordinære dispensere)

Enterococcus faecalis             ATCC 29212 (1 ordinær dispenser)

Haemophilus influenzae         ATCC 49766  (lappes for hånd, se nedenfor)

E.coli                                      CCUG 30600

 

NORM midler settes opp etter material og en tidsbegrenset periode.

 

E.coli ATCC25922	Staphylococcus aureus	Enterococcus faecalis	Haemophilus influenzae	E.coli CCUG 30600
Ampicillin 10	Cefoxitin	Ampicillin 2	Penicillin 1	Amoxicillin-clav.30
Cefotaxime	Fucidin	Gentamicin 30	Amoxicillin-clav. 3
Ceftazidime	Penicillin	Imipenem	Cefuroxime 30
Cefuroxime	Trimetoprim-sulfa.	Linezolid		Piperacillin-tazobactam 1 gang pr.uke for å kontrollere inhibitor
Cefepim	Erytromycin	Tigecyklin
Gentamicin 10	Klindamycin	Vancomycin
Trimetoprim-sulfa.	Ciprofloxacin
Aztreonam	Linezolid
Ciprofloxacin	Rifampicin
Imipenem	Gentamicin 10
Tobramycin	Tetracyklin
Piperacillin-tazobactam	Tigecyklin
Meropenem	Mupirocin 1pr uke
Amikacin	oxacillin 1pr uke
Amoxicillin-clav. 30	amoxicillin-clavulan 3, 1pr uke
Tigecyklin
Cefalexin
Mecillinam
Trimetoprim
Nitrofurantoin

 

 

EKSTERN KVALITETSKONTROLL

Med. mikrobiologi er med i ringtestprogrammet til Folkehelseinstituttet og Neqas.

 

ANSVAR

Fagbioingeniør I har ansvar for oppdatering av denne prosedyren. Spesialbioingeniør ved denne fagruppen har ansvar for mottakskontroll av de ulike antibiotika. Faggruppen vurderer trend en gang i året i samråd med medisinsk faglig ansvarlig.

 

Bioingeniørene på urin lab har ansvar for den daglige testingen. Oppsett av NORM-midler gjøres samtidig. Pusslaben ansvar for å ta ut dispensere, back-up boks med antibiotika, boks med enkelt dispensere og resistensskåler på morgenen hver dag.

 

Prøvemottaket har ansvar for skifte/tørking av tørremiddel i dispenserboksene. Det kviteres på loggliste at dette er gjort. Putene står i tørkeskapet til de skal skiftes. De må påse at de tørkes dagen før de skal byttes.

ARBEIDETS GANG

 

Stammer, reagenser og klargjøring av disse

Kjente referansestammer er nedfrosset i - 70ºC. i det kommersielle systemet Mikrobank.

Systemet består av kryorør med 25 kuler og en definert preserveringsløsning.

Rutiner for spreing av kontrollstammer se prosedyre ALM-MM-Bakt; Etablering og drift av stammebank.

Uåpenede rør med antibiotikalapper skal oppbevares ved –20 grader C til  8 grader C inntil de skal brukes. Uåpnede rør skal ha romtemperatur, før de fjernes fra forpakningen for å eliminere kondensasjon.
Ved mottak av antibiotikalapper, kontrolleres lappen mot aktuelle kontrollstamme. Se EQS vedlegg 18571 ”oversikt over kontrollstammer til bruk ved mottak av antibiotika”. Resultatet skrives inn på skjema ”mottakskontroll og forbruk av antibiotika. (EQS vedlegg:18151)

Når nye rør fra samme lot tas i bruk:  Skriv på datoen på røret når nytt rør tas i bruk
 

Når rørene er åpnet, skal de oppbevares stående i dispensereren som plasseres i den medfølgende beholderen. Beholderen med dispenser skal oppbevares i kjøleskap og skal ha romtemperatur, før den åpnes. Hvis rørene ikke anvendes sammen med en dispenser, skal en sørge for at lappene oppbevares i tett boks med tørkemiddel i kjøleskap. Holdbarhet på rørene, se avvik fra hovedreferansen.

I bunnen av dispenserboksene er det et tørkemiddel. Dette skal tørkes hver tirsdag og putene skiftes i alle dispenserne denne dagen. Tørkeputene tørkes over natt ved 50ºC i 10-20 timer. Vi har doble sett med tørkemiddel. Se under ansvar

Feilkilder og interferens

• Feil inokulat. Det skal være 0,5 Mc Farland. Dette tilsvarer 1-2 x 10⁸ CFU/ml for E.coli.
• Må være renkultur
• Antibiotikadepoer legges på når skåla er tørr.Ved for sen pålegging vil påbegynt vekst gi mindre soner. For sein inkubering vil gi for store soner.
• Skåler og saltvann skal ha romtemperatur.
• Resistensskåler bør ikke inkuberes i for høye stabler ( max. 3 anbefales.)
• Det bør ikke være flere lapper på skålene enn at man kan se sonene rundt alle lappene. Unntaksvis kan man lese av radius og multiplisere med 2.
• Langsomtvoksende stammer vil gi feil resultat.
• Fuktighet  i skålene
• Holdbarhet på lappene.

 

Fremgangsmåte/Utførelse av analysen

Medier:

Vi kjøper skåler fra St.Olavs hospital, Lab. for med. Mikrobiologi. Disse er ferdig kontrollert.

Vi utfører daglige kontroller på nøyaktighet og presisjon.

Tabell 1. Medier til resistensbestemmelse av ulike bakterier

Bakterieart	Medium
Enterobacterales Pseudomonas spp. Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp.	Mueller-Hinton (MH)
Streptococcus pneumoniae Streptokokker gr. A, B, C og G Andre streptokokker Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis Campylobacter spp.	Mueller-Hinton + 5 % defibrinert hesteblod + 20 mg/L β-NAD (MH-F)

 

• Tørking og oppbevaring av agarplater

alle res.agarplater fra SOH skal i stativ på kjølerommet ved mottak. Sett plastikkpose over stativene på kjølerommet for å unngå uttørking fra vifta.

 

• Sjekk at vi har stativ med res.agar stående på tralle og benk til enhver tid.(disse skal være «sappet» ut)
• La alltid ca.40 MH-skåler og ca.10 MH m.βNAD-skåler stå på benk over natt.
• Platene skal ha romtemperatur før inokulasjon.
• Overflaten skal være tørr. Dette for å unngå «fuzzy-soner», «frynsete-soner»og«tåkete-soner»

• Ingen dråper bør kunne sees på overflata av agaren eller innsiden av lokket

Hvis nødvendig , 35°C med avtatt lokk i 15. min

 

Inokulum:

• Til inokulering av skåler benyttes en bakteriesuspensjon på 0,5 McFarland i 0,85 % saltvann. For å få en representativ bakteriepopulasjon må flere kolonier (5-10) berøres når inokulum lages. Strept.pneumoniae skal være 0.5 McF fra blod og 1.0 McF fra sjokolade.
• Inokulatet tillages fra en fersk kultur (< 24 timer) på en ikke-selektiv agarskål. Suspensjonen må være homogen. Ved mukoide og tørre kolonier kan suspensjonen gjøres homogen med vortex-mikser. Bakteriesuspensjonen justeres ved å tilsette mer bakterier eller saltvann slik at den inneholder den ønskede tetthet før utsæd. Til måling av tetthet skal en bruke densitometer.
• Gram negative: klemme ut væske fra bommulspinne mot kanten av røret før pårulling av skåler.
• Gram positive: ikke klemme ut væske fra bommulspinne mot kanten av røret.
• Res.oppsett => 15 X 15 X 15 (15 i oppslemming(kan stå i 60 min), 15 min etter pårulling og 15 min etter inokulering på benk) før den skal i inkubator.

 

Antibiotikalapper

 

• 1 mnd.holdbarhet (egendefinert)
• La dem stå på benk på dagtid – settes på kjøla når arb.dagen er slutt.
• Ikke bruk disk.diff.lappe som er utgått på dato – expiry date. Hvis nødvendig å bruke disse ta med en kontroll.

·         Unngå overlapping av soner. Viktig at vi kan lese sonediameter
Lappene må ikke flyttes etter at de har berørt agaren. Påse at hele lappen ligger mot agarflaten.

 

 

Inkubering

• Skålene skal stå opp-ned. La disk.diff.lappene feste seg litt – stå rette veien et lite minutt før skålene settes opp-ned.
• Settes i stativ med trekk over, evnt i pose med ikke mer enn 4 skåler i høyden

• Start inkubering innen 15 minutter etter at antibiotikalappene er applisert
• MH-agar i vanlig atmosfære, 35 ± 1 ^oC i 18 ± 2 timer.

MH-agar m .β-NAD i vanlig atmosfære med CO₂

 

 

Tabell 2. Inkubering av skåler

 

 

Bakterieart	Inkubering
Enterobacterales	35 ± 1 oC i vanlig atmosfære i 18 ± 2 timer
Pseudomonas spp.	35 ± 1 oC i vanlig atmosfære i 18 ± 2 timer
Stenotrophomonas maltophilia	35 ± 1 oC i vanlig atmosfære i 18 ± 2 timer
Acinetobacter spp.	35 ± 1 oC i vanlig atmosfære i 18 ± 2 timer
Staphylococcus spp.	35 ± 1 oC i vanlig atmosfære i 18 ± 2 timer
Enterococcus spp.	35 ± 1 oC i vanlig atmosfære i 18 ± 2 timer
Enterococcus spp. for vancomycin	35 ± 1 oC i vanlig atmosfære i 24 timer
Streptokokker gr. A, B, C, og G	35 ± 1 oC i 5 ± 1% CO2-atmosfære i 18 ± 2 timer
Andre streptokokker	35 ± 1 oC i 5 ± 1% CO2-atmosfære i 18 ± 2 timer
Streptococcus pneumoniae	35 ± 1 oC i 5 ± 1% CO2-atmosfære i 18 ± 2 timer
Haemophilus influenzae	35 ± 1 oC i 5 ± 1% CO2-atmosfære i 18 ± 2 timer
Moraxella catarrhalis	35 ± 1 oC i 5 ± 1% CO2-atmosfære i 18 ± 2 timer
Campylobacter spp.	42 ± 1 oC i mikroaerofilt miljø i 22 ± 4 timer

 

 

 

Tabell 3. ”15 +15 +15 minutters regelen”

 

15 minutter	Inokuler resistensskålene innen 15 minutter etter at bakteriesuspensjonen er tillaget (og aldri senere enn 60 minutter)
15 minutter	Legg antibiotikadepotene på resistensskålen innen 15 minutter etter inokulering av resistensskålen
15 minutter	Start inkubering av skålene innen 15 minutter etter at antibiotikadepotene er lagt på resistensskålen

 

 

Avlesning

Resistensskålene skal ha jevn konfluerende vekst slik at sonene lett kan avleses.

Sonene måles ved full inhibering bedømt med det blotte øye. Dette gjelder for både bakteriostatiske og baktericide midler. Avlesningen kan skje med linjal, skyvelær eller automatisk sonemåler. Gjennomsiktige medier leses av fra baksiden mot en mørk bakgrunn. Skåler tilsatt blod avleses fra forsiden etter at lokket er tatt av. Sonene leses av til nærmeste hele mm. Ved avlesning er det viktig med god belysning av skålen.

 

Tabell 4. Avlesning ved funn som krever spesiell oppmerksomhet

 

 

Bakterieart	Antibiotika	Avlesning
Proteus spp.	Alle	Overse sverming
Streptokokker	Alle	Avles vekstsone, ikke hemolysesone
Alle bakterier	Trimetoprim Trimetoprim-sulfamethoxazole	Overse svak vekst opp til lappen inne i sonen når denne har en tydelig rand
Stafylokokker	Linezolid	Undersøk med gjennomfallende lys (hold skålen opp mot lyset)
Enterobacteriaceae	Ampicillin	Overse svak vekst som kan opptre som en indre sone på enkelte batcher av MH agar

 

 

Diameteren sammenlignes med fastsatte artsrelaterte sonekrav for følsomhet.

Vurdering av svar

Daglige kontroller:

Hemningssonen ( i mm ) skal ligge innenfor gitte grenseverdier.

Hemningssonen avleses og skrives inn under FellesområdeI HNT-ALM fellesområde/Driftsenheter/MM/Daglige og ukentlige kontroller/År Resistenskontroller.

Det er excelskjema for hver stamme som skal testes.

Avleser skriver inn resultat og gir evnt. kommentarer

 

Aksjonsgrenser:

1 stopp, vurder skål/agar og komentér antatt årsak, for eksempel for tykk resistens eller for gamle lapper. Noter dette på skjemaet og sett inn evnt tiltak. Sett opp ny kontroll.

Hvis 3 av 4 påfølgende avlesninger er større eller lik 2 mm utenom median, kommenter resultatet, vurder antatt årsak. Følg feilsøkingsskjema. Kontakt fagansvarlig bioingeniør.

 

Årlig trendvurdering

Formål:

Det skal registreres middelverdi og median for alle referansestamme/antibiotikakombinasjoner vi utfører daglig kontroll på. Målet er at medianen skal være på mål ± 1 mm. Registreringsskjema finnes på filplassering I:\HNT - ALM Fellesområde\Driftsenheter\MM\Daglige og ukentlige kontroller\2023 Resistenskontroller\Trendvurdering

Ansvar:

Gjøres i starten av januar for foregående år. Dette skal vurderes og dokumenteres av faggruppen i samarbeid med medisinsk faglig ansvarlig, og en enkel konklusjon skal dokumenteres under hver vurdering.

Vurdering:

I tilfeller der medianen er >1 mm fra «target», vil det være behov for videre undersøkelse for å få oppdaget potensielle feilkilder.

Undersøkelsesflyt:

Er det flere QC-resultater med median >1 mm og på samme side (enten under eller over målet) for flere stamme/antibiotikakombinasjoner?

- Ja: Vanlige potensielle feilkilder kan være agaren eller dette kan skyldes systemisk feil ved lesing av soner. Ved mistanke om systemisk feil bør det vurderes å gjennomføre relevante leseøvelser blant alle ansatte i laboratoriet.

- Nei: Vanlige potensielle feilkilder kan være antibiotikalappen (eg. suboptimal oppbevaring etc.), agaren, en sone som er vanskelig å lese.

Vurder å sjekke for flere potensielle feilkilder. Se avsnitt «Feilsøking».

 

Feilsøking

 

·         feilsøking basert på AFA 

·         potensielle feilkilder i henhold til EUCAST sin veileder Disk diffusion - Slide show v 10.0

 

Systematiske avvik i sonestørrelser må føre til leting etter mulige feilkilder. De vanligste årsaker til avvikende sonestørrelser er lappene stått for lenge i dispenseren, feil inokulum, feil pH, overautoklavering av medier (gir lav ph),

samt feil agartykkelse. Vedlagte feilsøkningsskjema er en noe modifisert utgave av AB Biodisks skjema for metodekontroll ved resistensbestemmelser (AB Biodisk 01.90). Etter hvert som erfaring for andre årsaker til feil oppdages bør slike noteres og meddeles AFA.

 

 

Generelt for alle antibiotika

 

Avvikstype	Mulige årsaker	Mulige tiltak
1. For store soner	a. For tynt inokulat b. Gammel bakteriekultur c. < 60 ml agar/14 cm-skål     < 25 ml agar/9 cm-skål d. Lav inkuberingstemperatur e. Feil avlesningsrutine	a. Korriger inokulatet. b. Test fersk kultur c. Kontrollér agardybde     (4.0 ± 0.5 mm)                                       d. Kontrollér inkuberings-                                         temperatur og tid. Ikke stable for mange skåler i høyden.     Maks. 3 skåler i hver stabel e. Korreksjon ved opplæring
2. For små soner	a. Over holdbarhetstid for lappene b. For tykt inokulat c. > 60 ml agar/14 cm-skål     > 25 ml agar/9 cm-skål d. Inokulerte skåler får for lang tørketid (max. 15 min.) e. Feilaktig oppbevaring av      antibiotikadepoter f. Dårlig kontakt mellom depot og  agarflate    g. Feil avlesningsrutine	A Skift lapper b. Korriger inokulatet c. Kontrollér agardybde     (4.0 ± 0.5 mm)   d. Kontrollér tørketiden   e. Kontrollér oppbevaringsforhold     og holdbarhetsdato f.  Kontrollér påleggingssteknikk g. Korreksjon ved opplæring
3. Tilfeldige avvik	a. Ikke-standardisert inokulat b. Variabel mengde agar per skål c. Ujevn kvalitet på petriskåler    (konkav eller konveks bunn) d. Feilrapportert resultat     e. Ikke standardisert tillaging av medium f. Avvik på enkelte     referansestammer g. Ulike avlesningsrutiner         teknikerne imellom	b. Kontrollér tillaging   c. Kontrollér agardybden (over      hele skålen) d. Ved tvil om korrekt     rapportering av resultat, retest  med samme e. Kontrollér tilberedning og     autoklaveringsteknikk f. Forny eller prøv alternativ       referansestamme g. Korreksjon ved opplæring og  harmonisering

 

 

 Avvik som gjelder de enkelte antibiotika eller referansestammer

 

Avvikstype	Mulige årsaker	Mulige tiltak
1. Betalaktamantibiotika
a. For små soner (særlig     ampicillin, benzylpenicillin,     imipenem og aztreonam) b. Avvikende resultat for     mecillinam c. Avvikende resultat for     piperacillin samt aminotiazol-     cefalosporiner (som cefotaxim     og ceftazidim) d. For store oxacillinsoner	Feil oppbevaring. Utgått holdbarhetsdato. Ikke standardisert tilberedning av mediet kan påvirke osmolaritet og medikamentets diffusjonsevne. Ikke standardisert tilberedning av mediet, først og fremt overautoklavering. Kan forstyrre den biologisk tilgjengelige delen av kationer, som igjen påvirker disse antibiotikas aktivitet Feil inkuberingstemperatur eller mengde NaCl i mediet	Kontrollér oppbevaring og holdbarhet. Kontroller vannkvalitet mhp. ioneinnhold. Kontroller medietilberedning og autoklaveringsprosedyre. Kontrollér autoklaveringsprosedyre Kontrollér inkubasjonstemperatur og medietilberedning
2. Aminoglykosider
For små soner	Ikke standardisert tilberedning av mediet, først og fremt overautoklavering, kan forstyrre den biologisk tilgjengelige delen av kationer, som igjen påvirker disse antibiotikas aktivitet	Kontrollér autoklaveringsprosedyren
3. Tetracykliner
For små soner	Chelering mellom tetracykliner og citrat og acetat. F.eks. hvis citratblod anvendes kan det resultere i nedsatt aktivitet	Bruk bare defibrinert hesteblod
4. Polypeptidantibiotika
For små soner: gjelder colistin, polymyxin, bacitracin, vankomycin og teikoplanin	Disse antibiotika har forholdsvis høy molekylvekt og diffunderer derfor langsomt. Diffusjonshastigheten påvirkes av agarkonsentrasjon og kjemiske interaksjoner mellom preparatet og bestanddeler i mediet. Feil agarkonsentrasjon/gamle uttørkede agarskåler	Kontrollér tillaging av mediet og agarens overflatespenning. Skålene skal være høyst 4 uker gamle ved oppbevaring i plastposer
5. Sulfonamider
For små soner: Sulfametoksazole, trimetoprim/ sulfametoksazole	Den samlede mengden av PABA (paraaminobenzosyre) i et for tett inokulat er tilstrekkelig til å motvirke sulfonamideffekten	Kontrollér inokulatet (veksttetthet)

 

Avvik som gjelder de enkelte antibiotika eller referansestammer

 

Avvikstype	Mulige årsaker		Mulige tiltak
1. Antibiotika hvor aktiviteten minsker med lavere pH
For små soner: gjelder aminoglykosider, linkomycin, klindamycin, makrolider og kinoloner	Ved overautoklavering av mediet forstyrres mediets bufferkapasitet. Dårlig vannkvalitet kan også påvirke pH	Kontrollér autoklaveringsprosedyre og vannkvalitet. Mål pH på agaroverflaten med elektrode og temperaturkompensasjon. pH bør være 7,2-7,4
2. Antibiotika hvor aktiviteten øker med lavere pH
a. For store soner: gjelder     tetracykliner, nitrofurantoin,  novobiocin, oxacillin og fusidin	Ved overautoklavering av mediet forstyrres mediets bufferkapasitet. Dårlig vannkvalitet kan også påvirke pH		Kontrollér autoklaveringsprosedyre og vannkvalitet. Mål pH etter autoklavering på agaroverflaten med elektrode og temperatur-kompensasjon. pH bør være 7,2-7,4