Spesialbioingeniør, faggruppe I, har ansvar for vedlikehold av denne prosedyren. Alle bioingeniører som er opplært i denne prosedyren har ansvar for at prosedyren blir fulgt.
Medier: MH-agar både med og uten β-NAD blir kontrollert av leverandør og bør ha en dybde på 4,0 ± 0,5 mm. Det skal ikke være synlig fukt verken på agarens overflate eller i lokket før bruk. Agarskålene kan tørkes over natt i romtemperatur eller ved 35°C, med lokket av, i 15 minutter. Agarskålene skal ha romtemperatur før de tas i bruk. For oversikt over medier til resistensbestemmelse av ulike bakterier se Manual EUCAST Disk Test
Antibiotikalapper fra Oxoid: Resistenslappen består av 6 mm i diameter tynne papirlapper impregnert med en spesifikk konsentrasjon av et antibiotikum. Lappene har lang holdbarhet ved riktig lagring (-20 °C til 8 °C) og oppbevares på kjølerom RTB024. Resistenslappene ligger i rør med 50 lapper i hver. Disse er pakket i folie sammen med tørkepute for å opprettholde lav luftfuktighet for å sikre lang holdbarhet. Etter åpning skal rørene oppbevares stående i dispensere som plasseres i den medfølgende beholderen og skal oppbevares i kjøleskap (2-8 °C). Hvis rørene ikke brukes i en dispenser, skal de oppbevares i en lystett boks med tørkemidler i kjøleskap. Rørene er holdbar i 7 dager etter åpning. Husk å skrive dato på alle nye rør som tas i bruk som ikke står i dispenser.
· For høy eller lav suspensjon
· Urent bakterieisolat
· Feil agardybde
· Antibiotikalappen legges på for sent. På inokulerte resistensskåler som blir stående for lenge i romtemperatur kan bakteriestammen begynne å vokse, noe som kan føre til falske for små soner.
· For sen inkubering. Hvis resistensskålene blir stående i romtemperatur etter at lappene er påført, kan pre-diffusjon gi falske store soner.
· Agarskåler og saltvann har ikke blitt romtemperert
· Fuktige agarskåler
· Holdbarheten på antibiotikalappene
· For mange skåler i høyden. Kan gi ujevn fordeling av temperatur.
· Inkubering over det anbefalte tidsintervallet kan føre til vekst inni sonene og det vil være fare for at isolater blir rapportert som falsk resistent.
Resistensoppsett bør utføres etter kl. 11.00 da de fleste isolater skal inkuberes i 18 ± 2 timer.
15-15-15 minutter-regelen: Bruk suspensjon innen 15 minutter etter tillaging, legg på antibiotikalapper innen 15 minutter etter inokulering og inkuber resistensskålen innen 15 minutter etter at antibiotikalappene er påført.
Aktuelle isolater: Se NordicAST for en oversikt over hvilke bakterier det er utarbeidet sonegrenser for. (Unntak Anaerobe bakterier da diskdiffusjon ikke er verifisert ved MM Levanger for disse). Andre bakterier enn de som er nevnt i NordicAST er uaktuelle å resistensteste med lappediffusjon.
Inokulat: Lag en bakteriesuspensjon på ca. 0,5 McFarland (akseptabel variasjon 0,4-0,6 McFarland) i saltvann. Bruk alltid densitometer. Inokulatet skal lages fra en fersk bakteriekultur (inkubert over natt), velg det minst selektive mediet. Bruk flere (5-10) morfologiske like kolonier, når mulig, for å unngå å velge en atypisk variant. Inokulatet bør optimalt brukes innen 15 minutter og alltid innen 60 minutter etter tillaging. OBS: Streptococcus pneumoniae bør helst tas fra blodagar (0,5 McFarland). Hvis inokulatet lages fra sjokoladeagar må det være 1,0 McFarland (akseptabel variasjon 0,9-1,1 McFarland).
Gram negative: Klem ut væske fra bomullspinnen mot kanten av røret.
Gram positive: Ikke klem ut væske mot kanten av røret.
Dersom man skal bruke samme bakteriesuspensjon på flere agarskåler, husk å dyppe bomullspinnen i bakteriesupensjonen mellom hver skål.
Antibiotikalapper: Antibiotikalappene bør stå i romtemperatur i omtrent 1 time før bruk. Legg på antibiotikalapper innen 15 minutter etter inokulering av resistensskålen. Pass på at lappen har kontakt med agaren og den bør ikke flyttes når den er påført. Antallet antibiotikalapper bør begrenses for å unngå overlapping av soner og interferens mellom antibiotikum. Normalt sett er det maksimalt 6 antibiotikalapper på en 90 mm agarplate.
Induserbar clindamycinresistens: For å kunne detektere induserbar clindamycinresistens må clindamycin og erytromycinlappen plasseres med 12-16 mm mellomrom fra kant til kant.
Inkubering: Skålene skal inkuberes opp-ned i stativ med trekk over. Pass på at det ikke faller av lapper når skålen snus. Ikke plasser mer enn 5 skåler i høyden, før det lages et mellomrom. Inkuber resistensskålene innen 15 minutter etter at lappene er påført. For oversikt over inkubasjonsforhold og inkubasjonstid se tabell i Manual EUCAST Disk Test
Vancomycin på enterokokker: Skal settes opp på egen skål som settes i et eget stativ i inkubatoren. Husk å notere tidspunktet resistensbestemmelsen blir satt opp på resistensskålene og på primærskålen, da vancomycin skal leses av etter 24 timers inkubering.
Avlesning: Sjekk at sonene til resistenskontrollene er i akseptabelt område før avlesning av kliniske prøver. ALM-MM-Res; Internkontroll og resistensoppsett med agardiffusjonsteknikk. Resistensskålene skal ha jevn konfluerende vekst slik at sonene lett kan avleses. Sonene måles ved full inhibering bedømt med det blotte øye når skålen holdes på ca. 30 cm avstand. Dette gjelder både bakterostatiske og baktericide midler. Avlesning kan utføres med skyvelær eller tilsvarende hjelpemidler, mål ev. radius og multipliser med 2. Avrund til nærmeste hele mm. For gjennomsiktige medier leses de av fra baksiden mot en mørk bakgrunn. Skåler tilsatt blod avleses fra forsiden. God belysning er viktig.
|
Bakterieart |
Antibiotika |
Avlesning |
|
Alle bakterier |
Trimetoprim |
Overse svak vekst opp til lappen inne i sonen når denne har en tydelig rand |
|
Staphylococcus sp. |
Cefoxitin |
Undersøk sonen nøye for å detektere ev. kolonier i sonen |
|
Staphylococcus aureus |
Benzylpenicillin |
Undersøk sonekanten fra framsiden av skålen ved å holde skålen opp mot lyset. |
|
Streptococcus sp. |
Alle |
Avles vekstsone, ikke hemolysesone |
|
Enterococcus sp. |
Vancomycin |
Undersøkes ved å holde skålen opp mot lyset. Isolater bør ikke rapporteres som sensitiv før 24 timers inkubering. |
|
Enterobacterales |
Ampicillin Amoxicillin-clavuansyre |
Overse svak vekst som kan opptre som en indre sone på enkelte batcher av MH-agar |
|
Enterobacterales |
Mecillinam |
Ignorer enkeltkolonier i sonen og les av ytre sonekant |
|
E. coli |
Fosfomycin |
Ignorer enkeltkolonier i sonen og les av ytre sonekant |
|
Proteus sp. |
Alle |
Overse sverming |
|
Stenotrophomonas meltophilia, Achromobacter xylosoxidans og Burkholderia pseudomallei |
Trimetoprim-Sulfamethoxazole |
Ignorer vekst inne i sonen (Selv om det er betydelig vekst) så lenge det kan sees en sonekant. |
|
Haemophilus influenzae |
Betalaktamantibiotika |
Les av ytre sonekant når en ellers klar sone inneholder et område med vekst rundt antibiotikalappen |
Flere eksempler med bilder for avlesning av ulike soner finnes i EUCAS reading guide
Bruk NordicAST sin brytningspunkttabell.
Vurder også stammen med hensyn til diverse resistensmekanismer:
· Betalaktamaseproduksjon. Se ALM-MM-Res; Påvisning av betalaktamaseproduksjon hos bakterier.
· MLS. Se ALM-MM-Res; Generelt om resistensoppsett, inkl. EUCAST
· ESBL. Se ALM-MM-Res; ESBL av Enterobacterales, Pseudomonas sp, Acinetobacter sp
· Aminoglykosidresistens. Se ALM-MM-Res; Generelt om resistensoppsett, inkl. EUCAST
· VRE. Se ALM-MM-Fæces; Vancomycin Resistente Enterokokker (VRE) screening
· PBP3 mutasjoner. Se ALM-MM-Res; Avlesning av Haemophilus influenzae
OBS: Linezolidresistente enterococcus sp. og staphylococcus sp. er uvanlig. Gjenta arts- og resistensbestemmelse.