ALM-MB-L; Spektrofotometri av spinalvæske v. 1.6

Arbeidsbeskrivelse

ANSVAR

Fagbioingeniør og / eller spesialbioingeniør har ansvar for prosedyren og oppdatering av denne. Alle som har fått opplæring og er godkjent for analysen Spektrofotometri av spinalvæske på Shimadzu Spectrophotometer UV-1601 er ansvarlig for at prosedyren blir fulgt.

HMS/sikkerhetsinformasjon

Bruk av hansker vurderes av den enkelte, da det er humant materiale og søl av væske kan forekomme. Se overordnet prosedyre; Usterile engangshansker. Valg og bruk av usterile hansker.

ARBEIDETS GANG

Spesielle forhold vedr. godkjenning av rekvisisjon og prøvemateriale

Analysen utføres i spinalvæske, vi trenger 1,5ml. Det minst blodtilblandede glasset benyttes (optimalt 4. glass). Aktuelle prosedyrer: SL- Oppdekking og assistering ved spinalpunksjon og ALM-MB; Spinalvæskeundersøkelse

Analysen rekvireres i ROS: SP- spektrumanalyse (Xantokromi).

Prøvematerialet og bearbeidelse av dette

Spinalvæsken skal lysbeskyttes, sentrifugeres og avpipeteres innen 1 time etter prøvetaking for å unngå hemolyse in vitro. Sentrifugeres ved >2000 rpm i 5-10min (vi sentrifugerer som serum gelglass). Sentrifugert og avpipettert spinalvæske oppbevares mørkt i kjøleskap før analysering.

Analyseutstyr:
Shimadzu UV-1601 spektrofotometer med printer: OKI Mikroline 208.

Engangs kuvetter med lysvei 1cm, kuvetta må være 3/4 fylt.

Feilkilder og interferens

Blodtilblandet spinalvæske må sentrifugeres og avpipetteres raskt, innen 1 time, for å unngå hemolyse in vitro.
Oksyhemoglobin kan sees både etter subaraknoidalblødning og ved innstikksblødning.
Spinalvæske som ikke lysbeskyttes kan gi falskt negativt svar på bilirubin.
Sp-bilirubin kan bli falskt forhøyet ved høy serum-bilirubin (mengden bilirubin i spinalvæske er proposjonal med serum bilirubin).
Økt mengde spinalprotein gir absorbansøkning.

Fremgangsmåte/Utførelse av analysen

Sjekk at det er tomt for kuvetter i kuvettehuset.
Slå på hovedbryteren på venstre side av instrumentet, ikke åpne dekselet mens initialisering pågår, tar ca 5min.
Slå på printer.
Når ”SELECT” - lys på printer lyser grønt er printer on-line, klar til bruk. Hvis det ikke lyser er printer off-line, trykk på SELECT-knappen for å skifte mellom disse. For å benyttte FEED-knappen må printer være off-line. OBS: Hvis printer er off-line vil spektrofotometeret ”henge seg” når utskrift velges, sett skriver on-line.
Når initialiseringen er ferdig, trykk <2> (Spektrum). Her velges parameter-innstilling for spekteret. Parametrene settes ved å velge aktuelt parameternummer fra <1> til <6>, tast inn ønsket verdi, bekreft med ENTER. Se på skjerm for valg av parameter-innstilling og valg av verdi. Hvis du taster feil, trykk: RETURN

Følgende parameter skal velges:

1. Meas.Mode: ABS (trykk evt <1> flere gang til ABS kommer opp)

2. Scanning range: 600nm ~350nm

3. Rec.range: 0.00A ~ 0.50A

4. Scan speed: Very Fast

5. No. of scans: 1

6. Display mode: Sequential

Velg F1 (BaseCorr) for å korrigere basislinjen, tar ca 1 min. Når målingen er ferdig høres tre raske ”bip”. Kontroller at verdien i høyre hjørne på skjermen er 0.000A. (Hvis ikke, velg AUTO/ZERO ).
Spinalvæske fylles i ren kuvette (3/4 full) og plasseres i fremste posisjon i kuvettehuset. (Tips: ikke trykk kuvetten helt ned i holderen, da er det vanskelig å få den opp.) Lukk dekselet.
Trykk START/STOP. Spinalvæsken scannes og kurven kommer frem på skjermen. Hvis kurven går over 0.50A må akseverdien endres. Akseverdiene endres slik: velg F1 (Zoom). ”Markør” stiller seg over øverste abs.verdi, tast inn ønsket verdi, bekreft med ENTER. Abs.max kan stilles mellom 0,50A og 3,99A. Trykk ENTER for resten av parametrene for å få opp bildet av diagrammet med nye akseverdier.
Trykk F2 (DataProc) på instrumentet, deretter <3> (Peak) for å få en oversikt over evt. topper.
Trykk PRINT, deteksjon av absorbsjonstopper som er funnet skrives ut.
Velg F1 (Graph). Trykk PRINT, kurven skrives ut. Scanning av ny prøve: trykk RETURN 3 ganger.
Avslutning: Fjern kuvetten, slå av printer og instrument.

Hvis abs.maksimum er >3,99A, kan spinalvæske evt fortynnes med 0,9% NaCl.

Frem-mating av papir på skriver: velg SELECT-knapp, grønn lampe slukker, trykk LINE FEED evt FORM FEED.

Skifte av papir i printer

Slå på printer.
Sett den off-line m/ SELECT knapp.
Ta av deksel over skriverhode.
Sett ”hendler/spaker” på venstre og høyre side oppe på skriver mot deg.
Mat inn papiret, bruk ”valsehjulet” på høyre side.
Sett ”hendlene/spakene” tilbake.
Sett på dekselet.
Bruk LINE FEED knappen noen gang for å se om papiret mater korrekt frem.
Sett skriver on-line vha SELECT knapp (grønn lampe lyser.

Vurdering av svar

Tolkning av kurve

Oksyhemoglobin kan gi spinalvæsken en farge som varierer fra rødt over orange til orangegult. Det har en absorbsjonstopp ved 410-418nm. I tilegg kan ofte mindere topper sees ved 540 og 576 nm. Tilstedeværelse av oksyhemoglobin tyder på subaraknoidalblødning av ny dato.
Bilirubin vil gi spinalvæsken en gul farge. Bilirubin har et bredt absorbsjonsmaksimum ved 450-460nm, enten som en bred topp eller som en ”skulder” på oxyhemoglobintoppen. Bilirubin tyder på subaraknoidalblødning av eldre dato.
Methemoglobin vil gi en svak brunlig farge. Methemoglobin har absorbsjonsmaksimum ved 403-410nm. Methemoglobin tyder på subduralhematom eller gjennombrudd av intracerebral hematom til subaraknidalrommet. Sees som oftest i kombinasjon med oxyhemoglobin og bilirubin.
Blodtilblanding: Umiddelbart etter en blødning er det nesten umulig å skille mellom en stikkblødning og en ”ekte” blødning. Vi vil i begge tilfeller få et absorbsjons-spektrum som viser tilstedeværelse av oxsyhemoglobin.
Blødningens størrelse: Spekteret kan ikke brukes til å si noe om en eventuell blødnings- størrelse.

Eksempel på kurver

Eksempel 1: Normal prøve

Spinalvæskens farge før sentrifugering: Fargeløs

Spinalvæskens farge etter sentrifugering: Fargeløs

Ingen absorbsjonstopp.
Svar: Det påvises ikke oksyhemoglobin, methemoglobineller bilirubin ved spektrofotometrisk analyse

Eksempel 2: Patologisk prøve

Spinalvæskens farge før sentrifugering: Blodtilblandet

Spinalvæskens farge etter sentrifugering: Fargeløs

Absorbsjonstopp (Peak detection):    577.0   0.188
541.0   0.189
415.0   0.358

Svar: Absorbsjonsmaksimum ved 410-418 nm viser tilstedeværelse av oxyhemoglobin.

Eksempel 3: Patologisk prøve:

Spinalvæskens farge før sentrifugering: Rød

Spinalvæskens farge etter sentrifugering: Rød

Absorbsjonstopp (Peak detection): 403.0 1.275
Svar: Absorbsjonsmaksimum ved 403-410 nm viser tilstedeværelse av methemoglobin.

Eksempel 4: Patologisk prøve

Spinalvæskens farge før sentrifugering: Gul

Spinalvæskens farge etter sentrifugering: Gul

Absorbsjonstopp (Peak detection):    575.0   0.100
462.0   0.326
415.0   0.338

Svar: Absorbsjonsmaksimum ved 410-418 nm viser tilstedeværelse av oxyhemoglobin.
Absorbsjonsmaksimum ved 450-460 nm viser tilstedeværelse av bilirubin

Eksempel 5: Patologisk prøve

Spinalvæskens farge før sentrifugering: Gul

Spinalvæskens farge etter sentrifugering: Gul

Absorbsjonstopp (peak detection): 402.0 0.925 (Visuelt avlest ”skulder” v/450-465)

Svar: Absorbsjonsmaksimum ved 410-418 nm viser tilstedeværelse av oxyhemoglobin.
Absorbsjonsmaksimum ved 450-460 nm viser tilstedeværelse av bilirubin

REFERANSEOMRÅDE

Det påvises ikke oksyhemoglobin, methemoglobin eller bilirubin ved spektrofotometrisk analyse.

Godkjenning av svar

Papirutskriften merkes med etikett med pasientopplysninger, relevante opplysninger/vurderinger av spinalvæsken påføres. Angi på papirutskriften hvis noe avviker fra prosedyren. (Eksempel på merknader: ikke lysbeskyttet, avpipettert først x timer etter spinalpunksjon.) Utskriften settes i perm merket: Spektrofotometri av spinalvæske. Permen oppbevares på fordelingsrommet.

Resultat legges inn i Beaker ved bruk av definerte kommentarer i Mnemonikk. Noen kommentarer finnes ikke som Mnemonikk og disse må skrives manuelt. Utseende før og evt. etter sentrifugering skal alltid angis.

Ingen Mnemonikk: Spinalvæskens utseende/farge før sentrifugering:

Ingen Mnemonikk: Spinalvæskens utseende/farge etter sentrifugering:

7009: Absorbsjonsmaksimum ved 410-418 nm viser tilstedeværelse av oxyhemoglobin.

7010: Absorbsjonsmaksimum ved 450-460 nm viser tilstedeværelse av bilirubin.

7011: Absorbsjonsmaksimum ved 403-410 nm viser tilstedeværelse av methemoglobin

7012: Det påvises ikke hemoglobin bilirubin ved spektrofotometrisk analyse.

Ingen Mnemonikk: Spekteret er vanskelig å tolke. Vi kan ikke utelukke tilstedeværselse av: …….

Hvis spinalvæsken ikke er oppbevart/behandlet som beskrevet i kapitlet: Prøvematerialet og bearbeidelse av dette, legges følgende fastkommentar inn:

7013: Resultatet må tolkes med forsiktighet da behandling av prøvematerialet før analyse avviker fra godkjent prosedyre.

Vaktene gir ikke ut svar de er usikre på. Hvis kurven er vanskelig å tolke, kontakt rekvirent og gi ut et foreløpig telefonisk svar. Kurven legges til fagbioingeniør til neste dag.

Svarrapportering

Svarene rapporteres via laboratoriets datasystem. ALM-IKT; Svarrapportering, Beaker.

Papirutskriften settes i perm merket: Spektrofotometri av spinalvæske. Permen oppbevares på fordelingsrommet.

Hensikt

Sikre at utførelsen av analysen spektrofotometri av spinalvæske på Shimadzu Spectrophotometer UV-1601 gir et mest mulig korrekt og optimalt svar til rekvirenten.

Omfang

Prosedyren omfatter alle ansatte ved Avdeling for Laboratoriemedisin, Sykehuset Levanger, som er godkjent for å analysere spinalvæske på Shimadzu Spectrophotometer UV-1601.

Prosedyren beskriver behandling og oppbevaring av spinalvæske til spektrofotometrisk undersøkelse, bruk av spektrofotometeret og svarutgivelse/svarrapportering av undersøkelsen.

Grunnlagsinformasjon

HISTORIKK

Vi startet med analysering av spektrofotometri i spinalvæske i mars 2013 etter henvendelse fra medisinsk avdeling.

Prøver fra Sykehuset Namsos mottas for analysering fra medio januar 2014.

ANALYSEPRINSIPP OG TERMINOLOGI

Spinalvæsken undersøkes spektrofotometrisk og scannes i bølgelengeområdet 350-600nm (det synlige spekteret). Normal spinalvæske er blank og absorberer lite lys. Oxyhemoglobin, methemoglobin og bilirubin har forskjellige absorbsjonsspektra:

Methhemoglobin abs.maksimum: 403-410nm

Oksyhemoglobin abs.maksimum: 410-418nm (mindre topper kan ses ved 540 og 576nm)

Bilirubin abs.maksimum: 450-460nm

Oksyhemoglobin har et smalt og kraftig absorbsjonsmaksimum, bilirubin har en bred topp og methhemoglobin har en bredere topp enn oksyhemoglobin. Hvis det er både oksyhemoglobin og bilirubin tilstede, vil bilirubin være som en ”skulder” ved siden av den kraftigste toppen til oksyhemoglobin.

Xantokromi er bilirubin i spinalvæske.

MEDISINSK INDIKASJON

I følge litteratur er dette en nødvendig analyse ved mistanke om subaraknoidalblødning, spesielt hvis man ikke finner noe på cerebral CT. Hvis man får påvist en blødning kan man diagnostisere og behandle aneurismet, og dermed forhindre en reblødning.

Ved å fastslå hvilke hemoglobin-degraderingsprodukter som finnes i spinalvæsken, kan man si noe om hvilken type blødning som har forekommet, samt om blødningen er av ny eller eldre dato.

Umiddelbart etter en blødning i subaraknoidalrommet kan bare erytrocytter, men ikke fritt hemoglobin påvises i spinalvæsken. Etter 2-4 timer begynner erytrocyttene å hemolysere og de fagocyteres, og konsentrasjonen av oksyhemoglobin stiger. Denne når et maksimum etter 24-36 timer.

Samtidig omdannes oksyhemoglobin til bilirubin og noen ganger også til methemoglobin. Av disse tre pigmentene er det kun bilirubin som bare dannes in vivo. Oksyhemoglobin og methemoglobin dannes både in vivo og in vitro.

Bilirubinkonsentrasjonen stiger langsomt, og holder seg forhøyet i minimum 2 uker, også etter at oksyhemoglobin er forsvunnet. For å være sikker på å kunne påvise bilirubin i spinalvæsken, bør spinalpunksjon utføres tidligst 12 timer etter sykdomsdebut (bilirubin dannes 9-15 timer etter blødning).

I avkapslede blødninger i hjernen og i subduralhematom oksyderes hemoglobin til methemoglobin som kan påvises i spinalvæsken ofte i kombinasjon med oksyhemoglobin og bilurubin. (Methemoglobin er et sjeldent funn og er sannsyligvis relatert til omdannelse av oksyhemoglobin).

Det er ikke mulig å bruke spekteret til å si noe om blødningens størrelse.

Spektrofotomerti av spinalvæske er en øyeblikkelig hjelp analyse.

REFERANSER

Hovedreferanse: (1) Dokument 4636 ”Spekter av spinalvæske” AMBVer.1.9-EQS, fra SOH. Godkjent 09.03.2011 av Solem, Kristine Bodal (Kvalitetskoordinator).

Tilleggsreferanser: (2) Ann Clin Biochem 1 September 2003 vol.40 no. 5 481-488. National guidelines for analysis of cerebrospinal fluid for bilirubin in suspected subarachnoid haemorrahage (UK National Extrnal Quality Assessment Scheme for Immunochemistry Working Group.)

(3) Ann Clin Biochem 2008; 45: 238-244. Revised national guidelines for analysis of cerebrospinal fluid for bilirubin in suspected subarachnoid haemorrahage.

(4) Artikkel i Tidsskrift for den Norske Lægeforening nr.16- 25.august 2005: Subaraknoidalblødning med kun spektrofotometrisk påvist bilirubin i spinalvæsken. (Bø, Rud og Kravdal)

(5) Lab-info, Helse-Bergen, publisert 09.10.2009 og LaboratorieHåndBok-Ahus

Interne valideringer:ALM-MB-L; Validering for Spektrofotometri av spinalvæske (Ikke tilgjengelig)

Høring: Versjon 1.0 har vært på høring hos: Ragnhild Elgsæter, Ellen A.H. Gylland og andre ansatte ved MB.

Nyttig litteratur: Carl Kjelsberg, Joseph Knight: Body Fluids Third edition

R.Richterich:Klinishe Chemie, Kap VIIIa:Hemoglobin derivater, kapXIIa.1: Bilirubin

Saunders: Fundamendals of Clinical Chemistry, Kap 8 og Kap 12

METODENS YTELSE

Måleområde: Spektrofotometri 350-600 nm. Max. absorbsjon er 3,99A. Spinalvæsken kan evt fortynnes med 0,9% NaCl

Nedre og øvre deteksjonsgrense: Nedre: Absorbsjonstopp ved 403 nm.

Øvre: Absorbsjonstopp ved 576nm

Spesifisitet: Dette er en kvalitativ metode og spesifisitet kan ikke tallgis. Sansynligheten for å påvise absorbsjonstopper hos pasient uten subaraknoidalblødning er liten, forutsatt at det ikke oppstod innstikksblødning ved spinalpunkjonen eller at pasienten har førhøyet serum bilirubin.

Sensitivitet (følsomhet): Dette er en kvalitativ metode og sensitivitet kan ikke tallgis. Hvis subaraknoidalblødningen er liten, kan absorbsjonstoppene bli små og vanskelig å detektere. Bilirubun i spinalvæsken er den sikreste indikatoren på en blødning. Hvis spinalpunksjonen utføres før 12 timer ettter sykdomsdebut, er man ikke sikker på å kunne påvise bilirubin ved spektrofotometri.

EKSTERN KVALITETSKONTROLL

Bølgelengde riktighet for spektrofotometre, NKK (Nr. 8100) Første deltagelse i oktober 2013.

Deltakelse i 2013 og 2014, er tatt av programmet til NKK fra 2015.

OFTE STILTE SPØRSMÅL (FAQ)

Engangs kuvetter bestilles fra VWR art.nr.634-1921 HMN LØ nummer 4019175 (Kyvette for spektrofotometer, UVette® )

Papir til skriver: Dette er en gammel skriver, vi må høre med sentrallageret om de kan skaffe dette når det er 1/4 igjen i eska.

Blekk til skriver: Blekkpatroner kjøpt på nettet ligger på fagbioingeniørskontor

Forfatter:	Siri Amundsen (Overbioingeniør) Inger Annie Lillerønning Moe (Fagansvarlig bioingeniør)
Godkjent av:	Kjetil Landsem (Avdelingsleder)
Dokumentadministrator:	Inger Annie Lillerønning Moe (Fagansvarlig bioingeniør)
Dokument-ID:	17618
Gyldig fra:	31.10.2022
Revisjonsfrist:	30.10.2025