ALM-MB-Hem; Malaria, tillaging og farging av preparat v. 1.14

Hensikt

Sikre at analysen utføres forskriftsmessig.

Omfang

Prosedyren omfatter alle ansatte ved Avdeling for Laboratoriemedisin som er godkjent til å lage og farge malariautstryk.

Grunnlagsinformasjon

HISTORIKK

Giemsa-farging av blodutstryk (tykk/tynn) har i flere år vært i bruk ved avdeling til påvisning/typebestemmelse av Malaria.

ANALYSEPRINSIPP OG TERMINOLOGI

Tykk- og tynn-dråpe-preparat farges med Giemsa/Sørensens-fosfatbuffer for å kunne se parasittene i preparatet. Dessuten farges leukocyttene. Giemsa-løsningen inneholder azurblått som er et nøytralt salt som ioniserer i vannløsning og reagerer med motsatt ladde ioner i cellen. pH i fortynningsvæsken er av stor betydning for at resultatet skal bli vellykket.

I tynt utstryk ses erytrocyttene med eller uten parasitter. Tynt utstryk brukes for å typebestemme parasittene. Blodutstryk farget i fargemaskina kan i hastesituasjoner brukes til å se om prøven er positiv eller negativ.

I tykt utstryk er erytrocyttene hemolysert. Bildet domineres da av leukocytter og evt. parasitter. Tykt utstryk er 20 ganger tykkere enn tynt, og det effektiviserer letingen etter parasitter. Men man må fortsatt lete lenge! I tykk dråpe hos pasienter med malaria, kan en også finne utfelling av jern, pga destruerte erytrocytter.

MEDISINSK INDIKASJON

Mistanke om Malaria fra pasienter med feber etter opphold i Malaria endemiområde.

Fra WHOs ”International Travel and Health 2010”

Malariaep

Symptomer kan komme i løpet av 3 dager og opptil 1 år etter et slikt opphold (Pasienten kan også få symptomer etter flere år).

Type feber spiller ingen rolle når en har residiverende feber med symptomfrie intervaller på 48-72 timer eller uregelmessig feber.

Andre symptomer: hodepine, ledd- og ryggsmerter, diaré og trombocytopeni.

(Blodprøvetaking bør gjentas minst 2-3 ganger før man kan utelukke malaria hos en pasient hvor man mistenker slik sykdom).

 

Etiologisk agens

  • Plasmodium falciparum - Malaria tropica
  • Plasmodium vivax/ovale - Malaria tertiana
  • Plasmodium malariae - Malaria quartana
  • Plasmodium knowlesi - «Ape-malaria» (forekomst i sør-øst Asia - Borneo, Malaysia, Filippinene)

 

REFERANSER

Hovedreferanse:

1)      SL.P.1103 og SL.P 1103.501, Internt godkjente prosedyrer fra 1998.

2)      Hematology: Principles and Procedures, Barbara A. Brown, Lea & Febiger, Sixth edition, 1993 (ISBN 0-8121-1643-7).

Tilleggsreferanser:

3)      Malaria i Norge - diagnostikk, behandling og profylakse, B Myrvang, Tidsskr Nor Lægeforen 2000; 120:1648-52.

4)      Håndbok I mikroskopi, Morten Motzfeldt Laane og Thore Lie, Universitetsforlaget, sep. 1992.

5)      Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 15, No. 9, September 2009

 

Høring:

6)      Prosedyren har vært til høring hos driftsleder, bioingeniører ved Medisinsk biokjemi og overlege ved Medisinsk Mikrobiologi, Sykehuset Levanger og fagbioingeniør, Sykehuset Namsos.

 

KONTROLLER

Se ALM-; Sammenlignende laboratorieprøvinger (SLP, ekstern kvalitetskontroll, ringtest) - håndtering og vurdering.

 

OFTE STILTE SPØRSMÅL (FAQ)

Hvorfor løsner tykkdråpeutstryket ved Giemsa farging?

Hvis det er benyttet EDTA-blod har det ikke fått tørket lenge nok. Hvis det haster kan en benytte varmeskap.
Kapillærblod til tykkdråpe er bedre enn EDTA-blod (men brukes sjelden) dette fordi det fester seg bedre og ”flyter” ikke så lett bort ved farging.

Utstrykene bør farges liggende (som ved Gram-farging).

 

Hvorfor er fargingen for svak/sterk?

Viktig at en benytter fosfatbuffer med riktig pH. Se Feilkilder og interferens.

 

Hvorfor er det mye utfellinger på preparatene etter farging?

Viktig at en filtrerer den fortynnede fargevæsken rett før bruk. I tillegg er det viktig at en skyller bort fargevæska godt etter endt farging. Se Giemsa-farging pkt 4.4.

 

Arbeidsbeskrivelse

FLYTSKJEMA

1.                  Tillaging av utstryk

2.                  Fiksering

3.                  Farging

4.                  Giemsa-farging

5.                  Beskjed

6.                  Arkivering

ANSVAR

Fagbioingeniør og/eller spesialbioingeniør har ansvar for prosedyren, oppdatering av denne og besvarelse i Beaker. Alle som er godkjent for å lage og farge malariautstryk er ansvarlig for å gjøre seg kjent med og følge prosedyren.

 

HMS/sikkerhetsinformasjon

Alle blodprøver skal behandles som potensielt smittefarlig. Se prosedyre Usterile engangshansker - bruk.

 

HMS-datablad for reagensene forefinnes i Ecoonline

 

ARBEIDETS GANG

Spesielle forhold vedr. godkjenning av rekvisisjon og prøvemateriale

Ved rekvirering av malariautstryk brukes en egen rekvisisjon ”Vurdering av utstryk”. Den ligger i skuff ved fargemaskina (Levanger) / hylle over SR-maskin (Namsos). Sett på etikett merket Malaria.
Hovedsakelig tas det EDTA-blod, og utstrykene må lages innen 2 timer. Kapillærblod kan også benyttes (men brukes sjelden), da lages utstrykene umiddelbart. Kapillærblod er den beste løsningen mhp tykkdråpepreparat.

 

På rekvisisjonen skal det være anført

•         Relevant klinisk informasjon (hentes fra rekvisisjonen / kliniske opplysninger i RoS/Beaker, evt ring rekvirent)

•         Reiseanamnese

•         Bruk av malariaprofylakse

•         Om pasienten kan være delimmun (asylmottak)

Hvis kliniske opplysninger ikke er lagt inn, må vi etterspørre det fra avdelingen/rekvirenten.

 

Tilsendte utstryk fra legekontor i Namsosregionen / Sykehuset Namsos rekvireres av Sykehuset Namsos. Utskrift fra Sysmex skal være vedlagt i tillegg til at EDTA-blod skal være medsendt. Malaria antigentest skal være utført ved Sykehuset Namsos, og svar anmerket på rekvisisjonen.

 

Rekvirering i RoS:

•         Malaria utstryk og antigen eller

•         Malaria utstryk, ktr (uten antigentest)

Rekvirering i Beaker:

•         Malaria påvisning (utstryk og antigentest) eller

•         Mikroskopi malaria

Prøvematerialet og bearbeidelse av dette

EDTA-blod: Utstryk lages innen 2 timer.

Kapillærblod: Utstryk lages umiddelbart.

 

Reagenser og klargjøring av disse

 

Reagens

Lager

Tillaging

Metanol
2,5 L

I skap under vasken v/hematologi

Klar til bruk

Giemsa fargevæske
100 mL

I skap under vasken v/hematologi

Se Giemsa-farging

Giemsa buffer (Sørensens fosfatbuffer pH 7,2)
1 L

I kjøleskap v/ hem/koag

Se Giemsa-farging



Analyseutstyr og klargjøring av disse

•         Målesylinder (25 mL)

•         Erlenmeyerkolbe (250 mL)

•         Trakt

•         Filterpapir

•         Transporthylse til utstryk

Feilkilder og interferens

Fargeløsningen må filtreres like før bruk for å utelukke at fargekorn kan oppfattes som parasitter.

Viktig med riktig pH 7,2 på fargeløsningen. pH 7,2 gir beste kontrast. Se bilde:

pH_Innvirkning_Ved_Giemsa_Farging

Fremgangsmåte/Utførelse av analysen

 

1.      Tillaging av utstryk
Analyser prøven med diff og ta utskrift av plot.

Det lages 4 vanlige utstryk (Namsos lager 5) og 2 tykkdråpe-utstryk.

 

Sykehuset Namsos sender sine utstryk til Sykehuset Levanger for mikroskopering.

(Send alle unntatt ett vanlig utstryk, dette kan farges på fargemaskin på Namsos hvis legen etterspør. All farging for øvrig gjelder Levanger)

 


Se Figur 1: Tillaging av utstryk.

malaria__

Figur 1: Tillaging av utstryk

 

For Namsos: Lag ett ekstra vanlig utstryk som kan farges på fargemaskina der, i tilfelle en lege vil se på det.

  • 2 tykkdråpe utstryk lages.
    En dråpe blod dryppes på et objektglass og strykes utover med en pipette til en oval ”negls” størrelse. Rør godt. Dråpen skal ikke være tykkere enn at en kan lese skrift på en hvit bakgrunn når dråpen er tørr. Det er bedre at preparatet er litt for tynt enn for tykt. Preparatene lufttørkes minst 20 minutter ved kapillærblod. EDTA-blod kan trenge lengre tid for å feste seg godt til glasset. (Hvis det haster kan en benytte varmeskap)
    OBS! Tykkdråpeutstryk må ikke fikseres.

2.      Fiksering

2 vanlige utstryk fikseres i Metanol i 15 min. Kan bruke transporthylse til utstryk. Lufttørkes etterpå.

For Namsos: 4 tynne og 2 tykke utstryk sendes til Levanger for farging og mikroskopering. De utstrykene som skal fikseres må være fiksert før forsendelse.

3.      Farging

4.      Giemsa-farging

4.1.   Giemsa fargevæske fortynnes med Sørensens fosfatbuffer pH 7,2 i forholdet 1/10
(2,5 mL Giemsa fargevæske + 22,5 mL Sørensens fosfatbuffer).

Fargeblandingen filtreres før bruk. Løsningen har kort holdbarhet og kastes etter bruk.

4.2.   1 fiksert vanlig utstryk og 1 tykkdråpe utstryk farges i denne filtrerte løsningen i 20 min.
Utstrykene farges liggende over vasken!
OBS! Vær veldig forsiktig når fargeløsningen has på utstrykene.

4.3.   De to utstrykene skylles i Sørensens fosfatbuffer, før de til slutt settes på nytt i ren Sørensens fosfatbuffer i maks 5 min.

4.4.   Preparatene lufttørkes.

4.5.   Når preparatene er tørre, limes det på dekkglass vha. Eukitt, og legges sammen med rekvisisjon og utskrift av plot fra instrumentet ved mikroskopet.

5.      Beskjed

Når malariautstrykene er ferdige varsles Olav Fjære (tlf. 8132/977 09 254). Han besvarer utstrykene. Viktig med rask beskjed! (Det kan være en fordel å kontakte han før vi farger, slik at han vet om det!)
På vakt/helg tas det kontakt med vakthavende medisinsk lege, slik at han/hun kan ta ansvar for evt. vurdering av utstrykene.

 

6.      Arkivering
Utstrykene som legen ønsker å ta vare på arkiveres fortløpende i esker à 50 stk. Eskene merkes Malaria med påbegynt og avsluttende dato og år, samt eskens nr.

Vurdering av svar

Eksempler på resultat:

 

Plasmodium falciparum (Tykk dråpe (Giemsa)):

Plasmodium falciparum (tynn dråpe (farget i fargemaskin):

Blodutstryk

 

 

Plasmodium vivax (tynn dråpe (farget i fargemaskin):

 

Plasmodium vivax (Tynn dråpe (Giemsa)):

vivax

Plasmodium knowlesi

 

REFERANSEOMRÅDER

Negativ

Oppfølgende tiltak i forbindelse med svar

Positive svar blir varslet rekvirent av mikroskoperende lege.


I enkelte tilfeller kan mikroskoperende lege i samarbeid med kliniker ønske å sende prøven til videre utredning med PCR. (Husk rekvisisjon til OUS)
Aktuelle tilfeller kan være:

- usikker species-undersøkelse

- uoverensstemmelse mellom mikroskopifunn og resultat av hurtigtesten

- spørsmål om blandingsinfeksjon

- spørsmål om lavgradig infeksjon

Godkjenning av svar

Mikroskoperende lege skriver svar på rekvisisjonen. Svaret legges inn av Faggruppe 1 eller andre som har fått opplæring.

 

 

Resultat

 

SmartText

Tekst

Alle

-

Vurdert av dr…. (mikroskoperende lege)

Negativ

HMN HEM MALARIA MIKR NEG {LE}

 

(Kommentaren legges på automatisk ved negativt svar)

 

Ingen påvisning av Malaria plasmoider i tykk-/tynn-dråpe-preparat. Malariainfeksjon kan ikke utelukkes. Ved fortsatt mistanke om infeksjon anbefales ny prøve

 

Positiv

Svar legges inn i samråd med mikroskoperende lege.

 

Alle positive prøver meldes til Folkehelseinstituttet. Dette skjer automatisk når testen besvares positiv.

 

Rekvisisjonen arkiveres i perm sammen med andre blodutstryk.

 

Svar på Malaria antigentest vil foreligge før svar på mikroskopering, og vil bli lagt inn i Beaker så fort testen er utført.

 

Svarrapportering

Svarene rapporteres via laboratoriets datasystem.

Ved positive funn blir rekvirent oppringt / kontaktet av mikroskoperende lege.

Søkeord

Malaria, Plasmodium, Falciparum, Vivax, Ovale, Malarie, Knowlesi, Tykk dråpe, utstryk, Giemsa farge.