ALM-MM-Fæces; Vancomycin Resistente Enterokokker (VRE) screening v. 2.1

Arbeidsbeskrivelse

Ansvar

Fagbioingeniør, faggruppe II har ansvar for vedlikehold av denne prosedyren. Alle som er opplært i VRE-screening har ansvar for å følge denne prosedyren.

HMS/sikkerhetsinformasjon

Benytt hansker og smittefrakk ved utsåing av prøver. Såes ut i LAF-benk. Skålene kan vurderes på benk.

Arbeidets gang

Ekstern kvalitetskontroll

Med. mikrobiologi er med i SLP/ringtestprogrammet til Folkehelseinstituttet.

Intern kvalitetskontroll

Kontrollstammer som benyttes:

Enterococcus faecalis (ENFÆ) ATCC 29212	Negativ
Enterococcus faecalis VanB (ENFÆ) ATCC 51299	Positiv

Figur 1.0; Bildene viser skål med etiketter og oppvekst av positiv kontroll.

Prøvematerialet og bearbeidelse av dette

Ved screening for VRE-bærerskap anbefales alltid penselprøve fra rektum,
men alle materialer som er rekvirert for VRE-screening
kan benyttes (unntatt UTM med rød topp, for virus us).

NB: Merk at ESBL screening skal gjøres rutinemessig på alle VRE fra rektum dersom det ikke opprinnelig er bestilt fra rekvirent.

Innregistrering:

Søkeord i prosedyrefelt: VRE, velg prosedyre

Dersom det kun er mottatt prøver fra andre lokalisasjoner enn rektum skal følgende kommentar være med:

FVR1:

Ved screening for VRE–bærerskap anbefales alltid penselprøve tatt fra rektum.

Prøvemateriale tatt på Copan e-Swab (transportmedium) kan oppbevares og analyseres innen 48 timer (gjelder for rom.temp og 4-8°C).

Analyseutstyr og klargjøring av disse

Skålene oppbevares på kjølerommet i originalemballasjen (kjølerom K1).
Skålene må oppbevares mørkt og kjølig i originalemballasjen.

Oxoid Brilliance™ VRE Agar, heretter kalt VRE-agar, romtempereres før bruk. Når prøvene romtempereres MÅ de oppbevares mørkt, dekk til skålene med trekk. Sørg for at skålene er tørre før de tas i bruk.
NB: skålene kan IKKE tørkes/tempereres i inkubator før bruk.

BD CHROMagar Orientation Medium/Columbia CNA Agar (heretter kalt; urin-agar) benyttes for adekvat tatt prøve.

Feilkilder og interferens

• Kontaminerte skåler.

• Holdbarhetsdato er overskredet.

• Må ikke benyttes dersom det er fargeomslag i agar.

• Oppbevaring av skåler ved feil temperatur (frost/overoppheting).

• Lyseksponering, kan hemme kromegenskaper i mediet.

• Må stå aerobt uten syre (C0₂) syre kan forskyve pH balansen og dermed forringe chrom egenskaper.

• Kjøres ikke på WASP.

• Se for øvrig pakningsvedlegg under relatert.

Fremgangsmåte/Utførelse av analysen

Prøven såes ut i LAF-benk. Benytt hansker og smittefrakk.

Utsåing av pasientprøver:

NB: 1 pasientprøve pr agar.

1.	Vortex prøvemateriale i ca 5 sekunder.
2.	Benytt sterilpipette, drypp 1 dråpe på VRE-agar og urin-agar, så deretter ut med blå-øse i 3 kvadranter på VRE-agar, urin-agar som vanlig.

Utsåing av kontrollstammer:

Kontrollstammer skal være med ved hvert oppsett (1 pr dag).
Kontrollstammer tilsettes i copan E-swab husk å merke rør med kontrolletiketter og tilsatt dato.
Kontrolletiketter ligger på prøveplass.
Kontrollene kan benyttes i en uke etter at de er tilsatt i copan E-swab
Kontroll-agar merkes med etiketter for VRE kontroll. Benytt 1agar. Se figur 1.0

1.	Vortex prøvemateriale i min 5 sek.
2.	Benytt sterilpipette, drypp 1 dråpe på VRE-agar, så deretter ut med blå øse.

Prøver samt kontroller dekkes til med klede og inkuberes aerobt
(skap i12 salmonella/shigella inkubator, vanlig atmosfære) i 18-28 timer (ideelt 20-22 timer).
Skålene skal stå i 2 døgn. Dvs. at negative prøver kan besvares etter 48 timer.

Vurdering

Vekstkontroll av kontrollstammer skal føres i skjema for vekstkontroller.
Skjema tigger på Teams, mappe kontroller, skal føres i dokument:
registrering for daglige og ukentlige kontroller; i fanen for ESBL og VRE kontroll.

Fæces eller blodig materiale kan føre til fargeomslag i selve agaren. Dette skal ikke vurderes som vekst da positiv oppvekst vokser med tydelig kolonier.

Differensiering og/eller identifikasjon av isolatene på grunnlag av kolonienes farge og utseende.

Chrom-egenskap	Ved vekst på VRE-agar
Lys rosa/lilla farge:	E. faecium
Blå/grønn farge:	E. faecalis
E. cassiluflavus og E. galirnarium innhiberes stor sett på dette mediet. Ved påvisning av disse skal de jobbes med som mistenkt positiv.

Figur 1.1; Eksempler av forventet vekst på agar:

E. faecium, rosa/lilla kolonier E. faecalis blå/grønne kolonier.

Tolkning av skåler:

Ved ingen vekst SKAL skålene inkuberes i nye 24 timer.

De kromogene egenskapene til skåla skal bare benyttes til foreløpig identifikasjon av mikroben. All oppvekst skal identifiseres med Maldi-tof
ALM-MM-Bakt; MaldiTof massespektrometri, identifikasjon av bakterier og gjærsopp

Andre gram positive/negative bakterier skal stort sett inhiberes. Det samme gjelder for gjærsopp.

Ved funn av enterokokker på VRE-agar settes det opp resistensbestemmelse.

Relevant oppvekst spres på blodagar før resistensbestemmelse. Resistens skal ikke utføres direkte fra VRE-agar da antibiotika i mediet kan påvirke resultatet.
Spredninger gjort tidlig på dagen som umiddelbart settes i inkubator kan gi nok materiale til resistens på slutten av dagen.

*Alle nye funn av enterokokker inkludert E. casseliflavus* og E. gallinarum skal resistensbestemmes.**
Antibiotika	Diskdiffusjon	MIC
Ampicillin 2µg	JA	NEI
Gentamicin 30µg
Imipenem 10µg
Linezolid 10µg
vancomycin 5µg.		JA

For tolkning: se NordicAST.org

Videre arbeid med resistente stammer.

• E.faecalis og E.faecium:
Sendes K-res. For rekvisisjon; se under relatert.

• Andre enterokokker som f.eks: E.casseliflavus og E.gallinarum:
Ved unormal høy vancomycin MIC ≥32, sendes stammen SOH for vanA/B PCR.
Unntak: Ved mistanke om utbrudd skal de sendes direkte til K-res.

NB: Ved sending av stammer skal MIC verdi for vancomycin føres på rekvisisjonen.
Stammer med MIC < 32 kan besvares som ingen vekst.

Oppfølgende tiltak i forbindelse med svar, melderutiner og frysing av stammen

• Alle nye funn skal fryses i boks 5. Se under relatert.

• VRE er nominativt meldepliktig.

• Linezolidresistente enterokokker (LRE) er nominativt meldepliktig.

Se også: ALM-MM-Bakt; Melding til MSIS, smittekommentarer, frysing og sending av spesielle bakteriefunn ved bakteriologisk seksjon.

Definisjoner

Nytt funn:

Anses som nytt funn dersom det har gått mer enn 12 måneder mellom funn.

Utbrudd:

Def. av mistenkt utbrudd fra FHI:

To eller flere tilfeller av samme sykdom som mistenkes å ha felles kilde, eller
et antall tilfeller som klart overskrider det man ville forvente (det endemiske nivået - det normale bakgrunnsnivået av sykdommen) innenfor et område i et gitt tidsrom.
Kilde: Definisjon av utbrudd FHI

Tidligere påvist VRE/LRE

For VRE og LRE:
Konfirmasjonstest utføres en gang pr. kalenderår, hvis artsidentifikasjon er lik
Det er dermed ikke nødvendig med ny res.bestemmelse, kun identifisering på Maldi-tof.

Svarrapportering

Negative prøver skal besvares etter 48 timer.

Alle funn skal ha med smittekommentarer.
For smittekommentarer melde/varsle
se; ALM-MM-Bakt; Melding til MSIS, smittekommentarer, frysing og sending av spesielle bakteriefunn ved bakteriologisk seksjon.

Ved påvist VRE SKAL mikrobiolog varsles FØR prøven besvares (gjelder nye funn).

Alle funn skal varsles telefonisk til rekvirent.
Dette skal registreres i BEAKER kom.logg. Skal gjøres via oppfølgingsoppgaveliste.
Melding MSIS kommer automatisk opp i BEAKER.

Besvarelse VRE
Funn	Besvarelse
IV	NEG
VRE Nytt funn	POS Mikrobenavn Vancomycin resistent enterokokk påvist. .SMRA
VRE Tidligere påvist	POS Mikrobenavn Vancomycin resistent enterokokk påvist. .VREK .SMRA
Besvarelse LRE
Negativ	Besvares ikke til rekvirent. Skal kun ut til rekvirent ved positivt funn.
LRE Nytt funn	V Mikrobenavn Linezolid resistent enterokokk påvist .SMRA
LRE Tidligere påvist	V Mikrobenavn Linezolid resistent enterokokk påvist Tidligere påvist. .SMRA

Forklaring av kortkoder:

.SMRA	Smitteregime anbefales.
.VREK	Tidligere kjent positiv VRE

Dersom ingen vekst på urin-agar (gjelder ikke ved påvist VRE/LRE)
ta da med kommentarene, unntak her er opplysninger om immunsupprimert:
KPIT: Ingen vekst av tarmflora. Korrekt prøvetaking?
NYPA: Ny prøve anbefales.

Dersom stammen er både VRE og LRE, besvares prøven som nytt VRE og nytt LRE-funn.

Resistensbestemmelse skal ikke ut i svarrapport.

Sending av stammer

Kriterier for sending	Gjeldende isolater	Sendes til	MIC skal påføres rekvisisjon	Sendes på Copan Eswab m/hvit kork
Påvist VRE	E. faecalis/E. faecalis	K-res	JA
Påvist LRE	E. faecalis/E. faecalis	K-res	JA
Ved MIC ≥ 32	E.gallinarum/E.casseliflavus	SOH	JA
Ved mistanke om utbrudd	E. faecalis, E. faecalis, E.gallinarum, E.casseliflavus	K-res	JA

Stammer som sendes til SOH og K-res (ref.lab):

Merk: Det er kun isolater av E. galinarium/E. casseliflavus med MIC ≥ 32 som skal sendes SOH.

Ved sending til ref.lab:

1. Velg rekvisisjonsoppføring.

2. Legg til i prosedyrefelt: Mikrobiologi, referanselab, sendeprøve
(tips: søk i prosedyrefeltet med XS, trykk deretter enter)
Hak av for riktig ref. lab her; UNN.

3. Legg også til prosedyren Mikrobiologi, referanse lab, sendeprøve, svar (søkeord: XS).

4. Åpne pakkelisteredigering og scann inn prøven. Pakk og sendes til ref. lab.

5. Besvares som sendt.

6. K-res skal ha med utfylt rekvisisjon, ligger under relatert. Før sending: Husk å scanne rekvisisjon inn i BEAKER. Gjøres her:

Prøver til K-res skal sendes med post. Husk å merke konvolutt med klistremerke for biologisk materiale.
SOH sendes med kassen.

Ved sending SOH:

1. Velg rekvisisjonsoppføring.

2. Legg til i prosedyrefelt: søkeord VAN.

3. Velg analysen: Entreococcus spp. vancomycinresistens (vanA og vanB)

4. Trykk Lagre og motta.

5. Åpne pakkelisteregistreing og scann inn prøver.

Pakkes og settes i sendestativ på prøveplass.

Sendeprøver til SOH skal ikke besvares, disse svarene vil rekvirent få direkte fra SOH.
Sjekk opp når svar fra SOH foreligger. Når svar fra SOH konferer med lege.

Når svar fra ref.lab foreligger:

For besvarelse se EQSID: ALM-MM-Admin; Svarrapportering ved Lab. for medisinsk mikrobiologi.

Hensikt

Sikre riktig påvisning av vancomycin resistente enterokokker, VRE. Prosedyren gjelder ikke for vancomycin-variable enterokokker (VVE).

Omfang

Alle som er opplært til å utføre denne type analysearbeid ved Lab. for med. mikrobiologi.

Grunnlagsinformasjon

Analyseprinsipp og terminologi

Vancomycinresistens er vanligvis en ervervet form for reistens hos enterokokker. Ervervet glykopeptid-resistens (vancomycin) oppstår ved at D-Ala-D-Ala i stammepeptidet i celleveggen endres til D-Ala-D-Lac. Dette gjør at glykopeptidet ikke fester seg og celleveggsyntesen kan skje tilnærmet upåvirket tross behandling av glykopeptid (vancomycin). Resistensmekanismen er induserbar, det vil si at den bare slåes på ved tilstedeværelse av glykopeptid-antibiotika. Dette kan skape problemer i påvisning av nedsatt følsomhet for glykopeptider. Vancomycin-resistens gener koder for egenskaper som medfører denne endringen i celleveggen. Det er nå påvist flere vancomycin-resistens gener (vanA,B,D,E,G,L,M,N).

CHROMAgar™ VRE benyttes til påvisning av enterokokker med ervervet resistens mot vancomycin. Ofte vil dette være forårsaket av at bakterier er tilført vanA eller vanB resistensgener. Krom-agaren er selektiv, den er tilsatt antibiotika (patentert; produsenten oppgir ikke hvilke og hvor mye). I tillegg er agaren tilsatt kromogene substrater (patentert; produsenten oppgir ikke hvilke substrater) som gjør at Enterococcus faecium og Enterococcus faecalis vokser med rosa farge. Enretococcus gallinarum eller Enterococcus casseliflavus vokser med blå farge.

Enterokokker kan erverve resistens mot vancomycin via genetisk materiale som tilføres fra andre organismer. Denne resistensen sees oftest hos E. faecium og E. faecalis, men er også funnet hos E. raffinosus, E. avium, E. durans og flere andre enterokokkarter. Mange gener, inkludert vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG og vanL bidrar til resistens mot vancomycin hos enterokokker. VanA, B og C er de som vanligst forekommer.

Ordforklaringer:

Adekvat:	Helt dekkende eller fullgod, herunder - er prøven tatt fra rektum?
VanA:	Fenotypen er karakterisert ved at den vanligvis gir høygradig resistens mot både vankomycin og teikoplanin.
VanB:	Fenotypen gir vanligvis kun resistens mot vankomycin.

Medisinsk indikasjon

Enterokokker forekommer som en del av den normale tarmfloraen og finnes i store mengder på huden rundt endetarms- og urinrørsåpningen. VRE gir sjelden sykdom hos friske mennesker, men representerer en trussel for eldre pasienter og pasienter med underliggende sykdom. Hos enterokokker kan man grovt dele inn vancomycin-resistens i to grupper: Naturlig/iboende og ervervet resistens. E. gallinarum og E. casseliflavus/E.flavescens isolater er iboende/naturlig resistente mot vancomycin. Disse isolatene inneholder vanC gener som vanligvis gir lavgradig vancomycinresistens. Kombinasjon av både naturlig/iboende og ervervet resistens har blitt observert i senere tid i species som i tillegg innehar flere resistensgener.

Referanser

1.	Sikkerhetsdatablad for CHROMagar™ VRE.
2.	AFAs hjemmeside: NordicAST anbefalte metoder for påvisning av vancomycinresistens hos enterokokker.
3.	NordicAST.org Metodedokument; Enterokokker og vancomycinresistens.
4.	Center for disease controll and prevention-Overwiew of Vancomycin-resistant Enterococci (VRE).
5.	FHI
6.	Nasjonal strategi for forebygging av infeksjoner i helsetjenesten og antibiotikaresistens (2008-2012).
7.	Thermoscientific Oxoid Brilliance^TM VRE Agar.
8.	Infeksjonskontroll.no
9.	Metodedokument, Tittel: Enterokokker og vancomycinresistens. Av Dr. Truls Leergaard, revisjon: 5.
10.	Sikkerhetsdatablad (for ATCC 51299 og 29212) iflg. Forordning (EF) nr. 1907/2006, Artikkel 31 Versjon 2
11.	http://www.eucast.org klikk på: Resistance mechanisms. Dokument: EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance.
12.	Pakningsvedlegg, se under relatert.
13.	Valideringsrapport: EQS id: 27077.
14.	Prosedyre VRE fra SOH EQS id: 19456 og 9120.
15.	https://unn.no/fag-og-forskning/k-res#prioriterte-analyser-og-referansefunksjoner Hjemmeside K-res, under prioriterte analyser.
16.	Verifiseringsrapport VRE: ALM MM; Verifiseringsrapport VRE kromagar regionalt anbud 2022 (Ikke tilgjengelig)

Se også under relatert.

Forfatter:	Carina Williksen (Fagansvarlig bioingeniør)
Godkjent av:	Geir Kvam (Seksjonsleder) Kjetil Landsem (Avdelingsleder)
Dokumentadministrator:	Carina Williksen (Fagansvarlig bioingeniør)
Dokument-ID:	27331
Gyldig fra:	10.10.2023
Revisjonsfrist:	09.10.2026