Hensikt

Sikre at analysering av leukocytter (LPK) og differensialtelling i blod, på Sysmex XN, gir et korrekt og optimalt svar til rekvirenten.

Omfang

Gjelder alle ansatte ved Avdeling for Laboratoriemedisin som er godkjent for å analysere prøver på Sysmex.

Grunnlagsinformasjon

HISTORIKK

Leukocytter (LPK) og differensialtelling av disse har blitt analysert på ulike instrumenter i flere tiår. Sysmex XN-1000 ble tatt i bruk i 2015. Sysmex fungerte som back-up-instrument for Cell-Dyn Sapphire, pluss at de fleste tilsendte prøver ble analysert her. 2019 ble CellDyn byttet ut med Sysmex XN-1500.

Sysmex XN-1500 fungerer som hovedinstrument for ferske prøver og som back-up for Sysmex XN-1000.

 

ANALYSEPRINSIPP OG TERMINOLOGI

Terminologi:

Leukocytter måles som totalt antall. I tillegg deles de opp i en femparts differensialtelling hvor leukocyttene er inndelt i lymfocytter, monocytter og nøytrofile, eosinofile og basofile granulocytter.
Granulocyttene, og i mindre grad monocyttene, inneholder vesikler eller granula som produserer hydrolytiske enzymer, hydrogenperoksid og reaktive oksygenforbindelser. Ved å utnytte enzymet myeloperoxidase lages det steriliserende forbindelser som er svært viktige i vårt forsvar mot infeksjoner.

Nøytrofile granulocytter er fagocytterende celler. I beinmargen tar det 10-14 dager å produsere nøytrofile fra stamcellene. I blodbanen har de en halveringstid på 6-10 timer. Den korte levetida til nøytrofile gjør at en kontinuerlig produksjon er nødvendig for å opprettholde antallet. Medikament (for eks. cytostatika) eller sykdom kan føre til redusert produksjon, noe vi ser som nøytropeni.

I kontrast til andre typer celler, inneholder beinmargen et ”lager” av nøytrofile som er 10-20 ganger det sirkulerende antall. Infeksjoner og inflammatoriske lidelser kan føre til at dette ”lageret” slippes ut i blodbanen og antall nøytrofile stiger raskt. Slik mobilisering fører ofte til økt andel stavkjernede nøytrofile og av og til metamyelocytter i sirkulasjonen.

Produksjonen av nøytrofile kan økes kraftig ved infeksjoner og inflammatoriske reaksjoner, men dette tar flere dager. ”Leukemoid reaksjon” betyr at nøytrofile > 30-50 x10⁹/l. Dette kan skyldes alvorlige infeksjoner, ”elektriske” skader, brannskader, visse solide tumorer og alvorlig traume.

Ca. halvparten av de nøytrofile som er utenfor beinmargen er løst festet til blodåreveggene og kalles den marginale pool. Resten av de nøytrofile utenfor margen kalles den sirkulerende pool. Ved stress (f. eks. at et barn skriker veldig i prøvetakingssituasjonen), angst eller ved bruk av ulike medikamenter (for eksempel steroider) skjer det en ”demarginalisering” av cellene. Det betyr at de nøytrofile løsner fra innsiden av blodåreveggen, noe som raskt fører til lett nøytrofili.

Eosinofile granulocytter er også fagocytterende, de har først og fremst betydning ved bekjempelse av parasittsykdom. Dessuten har de en modererende virkning på hypersensitivitetsreaksjoner bl.a. ved å motvirke stoffer frigjort ved mastcelledegranulering.

Basofile granulocytter er ikke fagocytterende. De sirkulerer i blodet, men kan bevege seg ut i vevet (mastceller). Mastcellene spiller en viktig rolle ved betennelsesreaksjoner og hypersensitivitetsreaksjoner.

Monocytter er effektive fagocytter. De kan vandre fra blodbanen ut i vevet og utvikle seg til makrofager. Makrofagene er stort sett opptatt med nedbrytning av kroppens egne celler og proteiner etter hvert som disse dør eller ødelegges, men de kan og gjøres oppmerksomme på noe som ikke er kroppens eget. Makrofagene har i tillegg egenskaper som gjør dem i stand til å hjelpe lymfocyttene, spesielt T-lymfocyttene til å gjenkjenne og reagere med fremmed materiale.

Lymfocyttene står for det spesifikke infeksjonsforsvaret. Blant alle cellene i kroppen vår er det utelukkende lymfocyttene som har evne til spesifikt å gjenkjenne fremmed materiale og skille dette fra kroppens eget. Lymfocyttene kan deles i ulike subpopulasjoner:

B-lymfocytter virker særlig mot ekstracellulære mikroorganismer og forbindelser. De kan utvikle seg til plasmaceller som produserer antistoffer.
T-lymfocytter utvikler seg enten til hjelperceller (produserer cytokiner som er med på å stimulere og regulere immunresponsen) eller dreperceller (dreper virusinfiserte celler og kreftceller). T-celler overvåker særlig det intracellulære miljøet.
Antall lymfocytter synker betraktelig ved strålebehandling, og dette er en tilstand som kan holde seg i flere måneder etter avslutta behandling.

 

Prinsipp:

 

WNR-kanalen:

Reagenset Lysercell WNR har lav pH. Det lyserer RBC (også NRBC) og PLT, mens WBC skrumper inn og cellemembranen gjøres permeabel. Kun basofile beholder sin størrelse, og kan dermed separeres fra andre WBC i WNR-kanalen.
Deretter tilsettes Fluorocell WNR som ”farger” DNA/RNA i cellene.
NRBC-populasjonen kan da separeres fra WBC pga ulik fluorescensintensitet.

I WNR-kanalen måles WBC, NRBC og Basofile granulocytter (men kan bare gis ut dersom det er analysert diff i tillegg)

 

WDF-kanalen:

Først tilsettes Lysercell WDF. Dette reagenset lyserer RBC og PLT, mens cellemembranen på WBC gjøres permeabel.
Så tilsettes Fluorocell WDF. Dette reagenset går inn i cellene og bindes til DNA/RNA i cellene (i kjernen, ribosomer, mitokondrier).

Et todimensjonalt spredningsskjema plottes ved hjelp av flowcytometrimetoden ved bruk av en halvleder-laser. De ulike subpopulasjonene av hvite separeres fra hverandre ved hjelp av intensiteten til lysspredningen ved ulike vinkler og fluorescens. I spredningsskjemaet representerer X-aksen lys som spres sideveis 90 grader (SSC) og Y-aksen fluorescerende lys som spres i 90 grader (SFL).

Dersom prøven er analysert i LW (lav-hvite-mode) blir LPK gitt ut fra WDF-kanalen.
Diff-parameterne (nøytro, lymfo, mono og eos) blir også målt i WDF-kanalen.

 

WPC-kanalen:

WPC skiller mellom blaster og abnormale lymfocytter.
Blaster er umodne celler med lite innhold av lipider i cellemembranen.
Abnormale lymfocytter er ofte modne celler med større innhold av lipider.
Lysercell WPC løser opp lipidene og gjør cellemembranen permeabel for farging med Fluorcell WPC (farger DNA). I flowcellen blir prøven belyst av en laserstråle. Dermed kan man skille disse ved at blaster ikke tar opp like mye farge som abnormale lymfocytter.

Det blir målt LPK i WPC-kanalen også, men dette blir aldri rapportert.

Generelt for alle kanalene (WNR, WDF og WPC) blir det gjort tre forskjellige målinger som gir forskjellig informasjon om cellene:

• Forward-scattered light / forover-spredet lys (FSC) – beskriver cellevolum.

• Side-scattered light / side-spredt lys (SSC) – beskriver intracellulær struktur / celleinnhold, som kjerneform og –størrelse, granula, vakuoler etc.

• Side-fluoresence light / side-spredt fluorescenslys (SFL) – beskriver mengden av nukleinsyrer / ”aktiviteten” i cellen.

REFERANSER

Hovedreferanse:	Sysmex brukermanual –22 (1)
Tilleggsreferanser:	Nasjonal brukerhåndbok medisinsk biokjemi –21 (2)
	Holdbarhet for hematologiske analyser ved Seksjon hematologi. AMB (SOH EQS 26842 v.3.5) (3)
Offisielle godkjenninger:	Leverandør er ISO-sertifisert 9001, Utstyr CE merket etter IVD direktivet. (4)
Interne valideringer:	ALM-MB-Hem; Validering av SYSMEX XN-1000 (Ikke tilgjengelig) og ALM-MB-Hem; Validering av Sysmex XN-1500

 

METODENS YTELSE

Måleusikkerhet:

Det blir beregnet gjennomsnittlig CV for instrumentet målt i kontrollblod i tre nivå. Hver annen måned (pga lotskifte) beregnes mean, CV og SD. Lagres i Teams.

Måleområde/linearitet:

0,1 - 440.0 x 10⁹/L

Nedre og øvre deteksjonsgrense:

0,1 - 440.0 x 10⁹/L

Presisjon (reproduserbarheten) og nøyaktighet:

Se ALM-MB-Hem; Validering av SYSMEX XN-1000 (Ikke tilgjengelig) og
ALM-MB-Hem; Validering av Sysmex XN-1500

 

STANDARDER / KALIBRATORER

Begge instrumentene kalibreres med XN CAL fra Sysmex. Dette gjøres hovedsakelig av Sysmex sine serviceingeniører når service blir utført. Kan unntaksvis utføres av  fagbioingeniør ved behov.

INTERN KVALITETSKONTROLL

Det benyttes tre kommersielle kontroller og pasientprøver som interne kvalitetskontroller.

Kommersielle kontroller fra Sysmex, brukes hver dag i 3 nivå.

-          XN Check Level 1

-          XN Check Level 2

-          XN Check Level 3

To nivå pr. instrument.

X-M - pasientmean over tid.

Tre pasientprøver samkjøres mellom instrumentene.

Se prosedyre ALM-MB; Sysmex XN

EKSTERN KVALITETSKONTROLL

Vi benytter kontroller fra NOKLUS som ekstern kontroll og følger deres program for kontrollnivå og hyppighet.
Resultatene ligger i kvalitetssystemet EQS.

Henviser til prosedyre: ALM-; Sammenlignende laboratorieprøvinger (SLP, ekstern kvalitetskontroll, ringtest) - håndtering og vurdering

ANALYTISK KVALITET

Tillatt totalfeil (TEA): 11%

Fastlagt etter en vurdering av analysens yteevne i forhold til de medisinsk behov.

 

Arbeidsbeskrivelse

Kort oversikt over WBC m/diff

● Prøvemateriale: EDTA-blod, citratblod, heparinblod

● Prøvevolum: 88 µL

● Standardpipettering. Ufortynnet.

● Metoder på instrumentet: Fluorescens flowcytometri.

● Betegnelse på instrumentet: WBC, NEUT, LYMPH, MONO, EOS, BASO

● Betegnelse i datasystemet: b-Leukocytter, b-Nøytrofile granulocytter, b-Lymfocytter, b-Monocytter, b-Eosinofile granulocytter, b-Basofile granulocytter

● Kalibratorer: XN-Cal fra Sysmex NO

● Kontroller: XN Check lav, normal og høy, pasientprøver

● Reagenser:

-          Lysercell WNR

-          Lysercell WDF

-          Fluorocell WNR

-          Fluorocell WDF

-          Lysercell  WPC

-          Fluorocell WPC

● Benevning: 10 ⁹/L

● Måleområde: 0,1 – 440,0 x 10 ⁹/L

 

ANSVAR

Fagbioingeniør og /eller spesialbioingeniør er ansvarlig for at instrumentet fungerer og at prosedyren er oppdatert.

Den enkelte er ansvarlig for å gjøre seg kjent med prosedyren etter opplæring. Den enkelte skal også forsikre seg om at instrumentet er i orden iht prosedyrene før start av analysering.
Ansvarlig fra Medisinsk-teknisk avd.er oppført i Medusa

HMS/sikkerhetsinformasjon

Alle blodprøver skal behandles som en potensiell smittefare.
Reagenser: Henviser til  Ecoonline.no

 

ARBEIDETS GANG

Spesielle forhold vedr. prøvetaking, prøvemateriale og forberedelse av pasient

Henviser til:
ALM-MB-pre; Blodprøvetaking av voksne og barn

Bruker fortrinnsvis EDTA- blod.
Unngå fysiske anstrengelser, stress eller injeksjoner av adrenalin forut for prøvetakingen.
Ved mistanke om kuldeantistoff forvarmes prøven til 37 grader. Heparin og Citratblod kan også brukes. Husk fortynningsfaktor ved bruk av Citrat-blod. Se Beregning av svar.

 

Holdbarhet
Se LPK (Leukocytt partikkel konsentrasjon) (Blod) ^{3 og}
Differensialtelling av leukocytter (Blod) ³

Analyseutstyr og klargjøring av disse

Instrumentet klargjøres etter prosedyre ALM-MB; Sysmex XN

Reagenser og klargjøring av disse

Produktdatablad for reagensene finnes på  Ecoonline.no 

Leverandør: Sysmex Norge

Alle reagensene kommer klar til bruk, og oppbevares i romtemperatur

•         Lysercell WNR
Holdbarhet:
Uåpnet: Til påtrykt utløpsdato.
På instrumentet: 60 dager.
Volum: 5 L

•         Lysercell WDF
Holdbarhet:
Uåpnet: Til påtrykt utløpsdato.
På instrumentet: 90 dager.
Volum: 5 L

•         Lysercell WPC
Holdbarhet:
Uåpnet: Til påtrykt utløpsdato.
På instrumentet: 90 dager.
Volum: 2 x 1,5 L

•         Fluorocell WNR
Holdbarhet:
Uåpnet: Til påtrykt utløpsdato.
På instrumentet: 90 dager.
Volum: 82 mL

•         Fluorocell WDF
Holdbarhet:
Uåpnet: Til påtrykt utløpsdato.
På instrumentet: 90 dager.
Volum: 82 mL

•         Fluorocell WDF
Holdbarhet:
Uåpnet: Til påtrykt utløpsdato.
På instrumentet: 90 dager.
Volum: 2 x 12 mL

Feilkilder og interferens

Interfererende substanser som kan gi falsk for høyt resultat:
- Trombocyttaggregater
- Kryoglobulin
- Fibrin
- Store trombocytter

Interfererende substanser som kan gi falsk for lavt resultat
- Leukocyttaggregering.

 

Fremgangsmåte/Utførelse av analysen

Se prosedyre: {{EQSDocument  5473 new}}

 

Beregning av svar

Svarene fra analyseinstrumentet gis direkte ut.

∙ Ved bruk av PT-INR-glass multipliseres LPK- og diff-resultatet med 1,11.

∙ Ved bruk av SR-glass multipliseres LPK- og diff-resultatet med 1,25.

Diff % er riktig uansett hvilket prøvemateriale som brukes.

Se prosedyre: ALM-MB; Sysmex XN

 

 

REFERANSEOMRÅDER

Voksne:
Hentet fra SOH: «Ref. området for voksne er funnet ved innkjøring av eget materiale (prøver fra 267 blodgivere) på Sysmex XN rev. 2018

Barn:
Aldrimer, M., et al., Population-based pediatric reference intervals for hematology, iron and transferrin. Scand J Clin Lab Invest, 2013. 73(3): p. 253-61
(Monocytter: Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC. Pediatric reference intervals, 7th ed.: AACC-press; 2011. 1)

Se LPK (Leukocytt partikkel konsentrasjon) (Blod) og
Differensialtelling av leukocytter (Blod)

Oppfølgende tiltak i forbindelse med svar

Se
ALM-MB; Sysmex XN Resultathåndtering i EPU og
ALM-; Ringerutiner for Medisinsk biokjemi og Blodbank

Vurdering og godkjenning av svar

Svarene verifiseres i EPU og overføres direkte til Beaker.
Svar som ifølge verifiseringsreglene ikke blir autoverifisert, vurderes manuelt (se ALM-MB; Sysmex XN Resultathåndtering i EPU) og godkjennes i Beaker.

 

Autoverifiseringen er satt til å gjelde LPK >3,0 og <20,0. Se Resultathåndtering for diff-parameterne. Svar utenfor disse grensene og/eller alarm på en eller flere analyser i prøven, blir holdt tilbake for manuell vurdering.

SVARRAPPORTERING

Se
ALM-MB-IKT; Manuell overføring av prøvesvar fra analysemaskin til online-PC og
ALM-IKT; Svarrapportering, Beaker

Videre svarrapportering er etter Avdeling for laboratoriemedisin sine rutiner.