ALM-BB-Lab; Blodtypeantistoff, Identifisering med gelkort-teknikk v. 6.4

Arbeidsbeskrivelse

FLYTSKJEMA

Flytskjema fra produsenten finnes på arbeidsbenken.

ANSVAR

Medisinsk faglig rådgiver har godkjent de teknikkene og arbeidsrutinene som følges. Fagbioingeniør er ansvarlig for at prosedyren til enhver tid er oppdatert.

HMS/sikkerhetsinformasjon

Konserveringsmiddel er Natrium-Acid (Utvikler giftig gass i kontakt med syre).
Alle reagenser og pasientprøver skal behandles som potensiell infeksiøse.

ARBEIDETS GANG

Spesielle forhold vedr. prøvetaking og forberedelse av pasient

Se prosedyre: ALM-MB-pre; Blodprøvetaking av voksne og barn

Prøvematerialet og bearbeidelse av dette

Vi bruker plasma fra EDTA-blod.

Reagenser og klargjøring av disse

ID-Diluent 2, produkt-ID: 05761, ref.nr: 009260 og ID Diluent 2 Rack ref.nr 009290.

Produsert av BioRad, levert av Norsk Labex

ID-DiaPanel, produkt-ID: 45161, ref.nr: 004114. Produsert av BioRad, levert av Norsk Labex

ID-DiaPanel-P papainized, produkt-ID: 45171, ref.nr: 004214. Produsert av BioRad, levert av Norsk Labex

ID-Card Coombs IgG, produkt-ID: 50540, ref.nr: 004025. Produsert av BioRad, levert av Norsk Labex

ID-Card ”NaCl, enzyme test and cold agglutinins”, produkt-ID: 50520, ref.nr: 005016. Produsert av BioRad, levert av Norsk Labex

Alle reagenser skal ha romtemperatur når de brukes.

For oppbevaring av reagenser, se egen reagensoversikt.

Analyseutstyr og klargjøring av disse

Pipetter.
Cellevaskerør, 12x75 mm levert av VWR.
ID-DiaCent, spesialsentrifuge for gelkort, produsert av BioRad, levert av Norsk Labex, innstilt på riktig hastighet og tid.
ID-Inkubator, produsert av BioRad, levert av Norsk Labex, innstilt på riktig temperatur og tid.

Fremgangsmåte

Manuell utførelse av analysen

· Identifisering rekvireres i Beaker. Velg fra hurtigknappene i Resultatregistrering eller velg Prøveoppslag, Prøveoppdatering, Tillegg og Nye forordninger. Bestillingen går over til IH Com.

· Det tilordnes kort i IHCom som tilhører ID-Reader, se prosedyre ALM-BB-Vakt; Bruk av ID-Reader med IH-Com.
Det tilordnes to NaCl-kort for identifisering i saltvannsteknikk, to for enzymteknikk, og to Coombs IgG-kort for LIAT teknikk.

· Autokontroll: Det skal være med en egenkontroll i saltvannsteknikk ved 20˚C og i LIAT-teknikk. Denne framstilles ved å blande 1.0 ml Diluent 2 og 10μl blodlegemer (cellesusp. 0,8 %). Blodlegemene må vaskes x1 hvis vi benytter blod uten tilsetning. Autokontrollen er da klar til bruk.

· IH Com merker gelbrønnene med nummer fra 1 til 11 og den siste brønnen med "Auto"

· Pipetter 50 μl testceller fra de nummererte panelcelleflaskene til de respektive gelbrønnene og 50 μl autokontroll i den siste brønnen.

· I de to kortene som brukes til enzymteknikk tilsettes 50 μl papainiserte testceller.

· Tilsett 25μl serum/plasma til alle brønnene med automatpipetten

· Inkuber LIAT og enzymteknikk i 15 min. ved 37°C i inkubatoren for gelkort.

· Saltvannsteknikken inkuberes 30 min. på benk. Vi setter kortene på sentrifugerommet (B035) fordi dette er det eneste rommet som har temperatur som ligger på 20-22 grader.

· Alle kortene sentrifugeres 10 min i gelkortsentrifugen.

· Les av kortene i ID-Reader og godkjenn resultatet, slik at reaksjonene går over til beaker.

· Overfør svaret til antigrammet som tilhører cellene. HUSK AT PANELCELLENE OG SKJEMAENE MÅ HA SAMME BATCH NR!

Analysering i IH 500

Sett inn begge ID-panelene fra BioRad og se etter at maskina har nok kort.

Identifisering rekvireres i Beaker. Velg fra hurtigknappene i Resultatregistrering eller velg Prøveoppslag, Prøveoppdatering, Tillegg og Nye forordninger. Bestillingen går over til IH Com.

Når analyseringen er ferdig, skrives resultatene over på antigrammet som tilhører ID-Panelet. Det er best å se på hver enkelt brønn i IH Com. Resultatene kan skrives ut fra IH Com, men utskriftene har dårlig oppløsning og er vanskelig å tolke. Reaksjonene går over til Beaker etter at resultatet er godkjent i IH Com.

Avlesing

Negative reaksjoner: Cellene legger seg som en knapp i bunnen av gelen.

Positive reaksjoner: Cellene ligger som et lokk oppå gelen eller fordelt ned i gjennom gelen. Reaksjonene skal graderes fra ++++ til +/-.

Nyttige tips i forbindelse med antistoffbestemmelsen

1. Positiv autokontroll kan tyde på at pasienten har et autoantistoff. Gradering av øvrige reaksjoner er viktig for å kunne vurdere evt. videre utredninger.
Positiv autokontroll er ikke alltid ensbetydende med positiv DAT (Direkte Antiglobulin Test). Det rekvireres og utføres DAT og evt. IgG og C3d når autokontroll i Indirekte Antiglobulin Teknikk er positiv.

2. En pasient med alloantistoff mot antigen på nylig transfunderte celler kan ha sirkulerende giverceller dekket med antistoff. Autokontroll kan bli positiv, men ofte som en partiell (delt) reaksjon. Dette kan mistolkes som autoantistoff. Transfusjonshistorie er viktig.

3. Negativ autokontroll og positive reaksjoner mot andre celler i ID-panelet tyder på tilstedeværelsen av ett eller flere alloantistoff.

Graderingen av de positive reaksjonene kan styrke eller minke sannsynligheten for tilstedeværelsen av flere antistoffer. Det må da også tas med i vurderingen at det kan være stor forskjell på styrken på en reaksjon alt etter om antigenet er homo- eller heterozygot (se doseeffekt).

Både positive og negative reaksjoner og graderingen av de positive reaksjonene er viktig informasjon i tolkning av identifiseringen. Negative resultat usannsynliggjør tilstedeværelsen av antistoff rettet mot respektive antigen, positive resultat bekrefter tilstedeværelsen av antistoff.

Doseeffekt

Celler fra personer som er homozygote for et antigen gir sterkere agglutinasjon med antistoff enn heterozygote gir. Noen antistoff har en mer tydelig doseeffekt enn andre, for eksempel anti-M og noen Rh-antistoff. For anti-M kan en ofte se at kun homozygote celler reagerer med antistoffet. Denne kunnskap brukes når reaksjonene i et ID-panel skal vurderes.

Spesifikke antistoff vil danne et eget mønster av positive og negative reaksjoner i antigendiagrammet. Man må være meget oppmerksom på at et antistoff kan dekke over et annet.

Systematisk "utkryssing" på antigendiagrammet ved å eliminere antistoff på bakgrunn av negative resultat er en metode for å bestemme antistoffet(ene). Det vil da komme fram om flere antistoffer kan være til stede.

Tolking av resultat
Dersom det er vanskelig å konkludere, skal identifiseringen også settes opp med annet panel. Vi har 2 11-cellers panel fra Ortho, Resolve B og Resolve C. Disse panelene må settes opp manuelt ettersom IH 500 ikke godtar celler fra annen leverandør enn BioRad.

Når vi setter opp antistoffidentifisering med Resolve B eller C, kan vi ikke skanne disse, ID-Reader kjenner dem ikke. Vi skanner ID-panelet fra BioRad. Ved avlesing legger vi inn kommentar: Utført med f.eks. Resolve C 8RC347 eller Resolve B 8RB372. Det er viktig at lot.nr på cellene er lagt inn.

Avvik fra denne regelen kan gjøres dersom undersøkelsen nylig er gjort.

På bakgrunn av punktene under "Nyttige tips" gjøres en konklusjon på hvilket/hvilke antistoff som mest sannsynlig er til stede.

Endelig antistoffkonklusjon kan ikke gjøres før:

1. Pasienten er typet på tilsvarende antigen og funnet negativ.

2. Minst to av cellene i undersøkelsen (ID-panel og screeningceller) har og minst to av cellene mangler antigenet/antigenene vi tror pasienten har antistoff mot.

Hvis kriteriet i pkt. 2 mangler, skal vi tilstrebe å oppnå dette ved videre undersøkelser. Hvis det er umulig, for eksempel ved sjeldne antigen eller at pasienten har mange antistoff, kan besvarelsen være: "mulig anti-..."
Hvis vi ikke finner noe spesifikt mønster ved identifiseringen, kan besvarelsen være: "uidentifisert antistoff". De ulike antistoffene reagerer ofte ulikt i de forskjellige teknikkene. Hvordan hvert enkelt oppfører seg, må en lære seg etter hvert, men en del tips finnes på oppslag på veggen på blodtypelab.

Konklusjonen skrives på skjema ALM-BB-L; Svar antistoff eller
ALM-BB-L; Svar antistoff homozygote. På gravide brukes skjema: ALM-BB-L; Svar antistoff gravide Skjema finnes som vedlegg til prosedyren.
Den som utfører antistoffidentifiseringen legger inn svar i P551, P552 og P583 i ProSang. Antigrammene skannes inn i Beaker. Skjema legges sammen med antigram for screening og antigram for antistoffidentifisering i en konvolutt merket med pasientens navn og fødselsnummer i merket skuff på blodtypelab. Endelig besvarelse gjøres av bioingeniør med godkjenning for verifisering av antistoffbesvarelse. Denne går inn i P968 og godkjenner det som er lagt inn, evt. forandrer tekst/legger inn tilleggstekst og signerer med navn og tittel.

Etterrekvirering av takster og analyser

Vi titrerer antistoff på gravide. Hvis antistoffet er svakt, er titrering unødvendig, se prosedyre: ALM-BB-Lab; Titrering av blodtypeantistoff hos gravide.

Videresending av antistoffutredninger

Hvis vi ikke greier å konkludere på en antistoffutredning, kan det være nødvendig å sende prøve til utredning ved SOH eller Ullevål.

Følgende prøver/utredninger bør videresendes (Veileder 11.5):

· Utredninger som ikke er konklusive

· Der forlikelig blod ikke kan finnes

· Der det er nødvendig å utføre fenotypinger vi ikke kan gjøre selv

· Pasientprøver hvor pasienten har autoantistoffer, og er transfundert i løpet av de siste 3 måneder (bl.a. for å utføre differensialadsorpsjon)

· Multiple antistoffer som krever videre utredning

· Mistanke om antistoff mot høyfrekvente antigener.

· Mistanke om antistoff mot et lavfrekvent antigen (husk å sende både pasient- og evt. giverprøve hvis utvidet forlik gir uventet/uforklarlig positiv reaksjon)

· AB0-problematikk

· D-varianter

· Utredning av DAT-problematikk.

Prøver som sendes andre laboratorier rekvireres i Beaker. Se prosedyre ALM-BB-Lab; Sending av prøver til og mottak av prøvesvar fra andre laboratorier

Rekvireringen gjøres for at vi skal ha oversikt over hvor og hva vi sender og settes igang fordi vi fikk en anmerkning om dette ved besøk fra NA i 2013.

Godkjenning av svar

Medisinskfaglig rådgiver er ansvarlig for besvarelse av antistoffutredninger,

men har delegert ansvaret for besvarelse av alle antistoffer til seksjonsleder

eller annen bemyndiget person. Se prosedyre ALM-BB-Lab; Irregulære blodtypeantistoff, utsending av svar.

Antistoffutredning og utredning av problem med forlik skal fortrinnsvis gjøres på dagtid. Unntak er når pasienten trenger øyeblikkelig hjelp transfusjon.

Hvis vi har problemer, kan vi konferere med bioingeniør eller vakthavende lege på AIT, St.Olavs.

Blodbanken, St. Olavs hospital, kortnr. **0414. Vakthavende lege har tlf. 46 80 62 25.

Svarrapportering

Se prosedyre ALM-IKT; Svarrapportering, Beaker.

Hensikt

Å utføre en antistoffidentifisering med korrekt framgangsmåte og teknikker.

Omfang

Prosedyren omfatter alle bioingeniører som er godkjent for å utføre analysen, den beskriver hvilket utstyr som er nødvendig, framgangsmåten, svarvurdering og lagring.

Grunnlagsinformasjon

HISTORIKK

Antistoffidentifisering har vært utført ved Blodbanken vår siden 1990. Vi bruker ID-DiaPanel til identifisering. Som tilleggspanel har vi brukt et 11-cellers panel fra Ortho. Fra 1. februar 2011 ble panelet fra Ortho byttet ut med Panocell som er et 16-cellers panel fra Berman Diagnostica. Fra september 2014 bytter vi ut Panocell 16 med 2 ulike 11-cellers panel Resolve B og Resolve C fra Ortho.

Fra april 2018 kan identifisering utføres i IH 500.

Bakgrunnsinformasjon

Alloantistoff mot erytrocyttantigen kan påvises i ulike tester der plasma og erytrocytter med alloantigen blandes; for eksempel ved ABO-typing, antistoffscreening eller forlik. Når et antistoff er påvist, skal spesifisiteten bestemmes og klinisk betydning vurderes. Et antistoff har klinisk betydning når det forkorter levetiden til transfunderte erytrocytter eller forårsaker HDN (hemolytic disease of the newborn). Graden av klinisk betydning varierer fra lettere transfusjonsreaksjoner der eneste symptom er at Hb ikke stiger som forventet, til transfusjonsreaksjoner med fatal utgang. Det kan variere alt etter hvilket antistoff som er til stede (om det for eksempel aktiverer komplement), men det kan også være variasjoner innenfor ett og samme antistoff. Klinisk betydelige antistoff er vanligvis aktive ved 37°C og lar seg påvise ved Indirekte Antiglobulin Test (IAT)

Alloantistoff reagerer bare med fremmede røde celler og har i de fleste tilfeller blitt dannet på bakgrunn av en immunisering mot erytrocytter forårsaket av graviditet, transfusjon, transplantasjon eller fra en injeksjon med immunogent materiale. I noen tilfeller kan en ikke finne årsaken. Alloantistoff kan også være naturlig forekommende.

Naturlig forekommende antistoff finnes innenfor en del blodtypesystem utenom ABO-systemet. Innenfor Rh-systemet kan anti-E og anti-C^w forekomme, innenfor MNS både anti-M og anti-S, og innenfor Lewis-systemet anti-Lea og anti-Leb. De fleste naturlig forekommende antistoff er IgM-klasse og reagerer i saltvannsteknikk ved 20 grader.

Blodtypeantistoffer av kuldetype kan påvises ved enkelte tilstander som KLL, SLE og andre. De er av IgM-type og identifiseres med saltvannsteknikk ved 20 grader.

Autoantistoff reagerer med egne erytrocytter og kan også reagere med erytrocytter fra andre individ. I de fleste tilfeller har autoantistoffene flere spesifisiteter, men de kan være spesifikke. For å skille mellom auto- og alloantistoff gjøres det alltid en autolog kontroll (egne celler mot eget plasma) ved identifisering. Både allo- og autoantistoff kan være til stede samtidig, og autoantistoff kan dekke over eller skjule et alloantistoff ved identifisering. Det kan da brukes metoder for å eluere og adsorbere autoantistoffet for å avdekke og identifisere eventuelle alloantistoff. Vi bruker PEG-teknikk til dette.

Hvis det er vanskelig å konkludere med de teknikker vi bruker, kan det være nyttig å følge noen av tipsene fra OUS som følger under:

Utdrag av OUS sin prosedyrehåndbok om hvilke teknikker som brukes i forhold til de enkelte antistoffer.

Antistoff i Rh-systemet (anti-D, -C, -c, -Cw, -E, -e): Påvises med IAT, men gir nesten alltid sterkere reaksjon med enzymteknikk.

Duffy-systemet (anti-Fya, anti-Fyb): Påvises i IAT og oftest sterkere i IAT/PEG. Antigenene ødelegges av enzym.

MNSs-systemet:
Anti-M/N: Påvises med IAT, reagerer ofte best ved 20 grader. Kan sette opp Liss/Coombskort ved 20 grader. IAT/PEG kan være et alternativ.

Anti-S/s: Påvises med IAT, reagerer i noen tilfelle bedre ved 20 grader, slik at vi kan sette opp Liss/coombskort ved 20 grader. Kan også påvises med IAT/PEG. Antigenene blir oftest ødelagt med enzymteknikk. Anti-s kan noen ganger reagere sterkere i enzymteknikk.

Kidd-systemet (Jka, Jkb): Påvises med IAT, men reagerer ofte bedre med IAT/PEG. Enzymbehandlede celler på IAT-gelkort er et annet alternativ. OUS innførte disse teknikkene fordi de er redde for å miste svake antistoffer i Kidd-systemet.

Ved mistanke om antistoffer i Lewis, P1, Lutheran brukes ikke IAT/PEG.

ANALYSEPRINSIPP OG TERMINOLOGI

Identifikasjonspanelet (ID-DiaPanel) inneholder røde blodlegemer fra 11 ulike spesialtypede givere. De er typet ut i de blodtypesystemer som har betydning for transfusjonen. Et positivt resultat, det vil si tilstedeværelse av antistoffer i pasientens plasma/serum som reagerer med antigenene på de røde blodlegemene, vises ved at blodlegemene ligger som et lokk oppå gelen eller som en sky ned gjennom gelen etter sentrifugering. Hvis pasientens plasma ikke inneholder antistoffer mot de aktuelle antigenene vil de røde blodlegemene passere gjennom gelen ved sentrifugering og legge seg som en knapp i bunnen av gelen.

Vi utfører alltid identifisering i tre teknikker: LIAT, enzymteknikk med papainiserte celler og saltvannsteknikk ved 20 °C.
Ved identifisering med LIAT, brukes gelkort hvor gelen inneholder polyspesifikt anti-humant globulin (AHG).
Til identifisering med enzymteknikk og saltvannsteknikk ved 20˚C brukes kort uten tilsetning til gelen.
De forskjellige antistoffene har reaksjonsoptimum ved ulike temperaturer og teknikker. Ved å utnytte den kunnskap vi har om de ulike antistoffenes reaksjoner sammen med det reaksjonsmønsteret vi får fram på antigrammet, kan vi bestemme antistoffet.

MEDISINSK INDIKASJON

Identifisering utføres på grunnlag av en positiv antistoffscreening. Identifisering er basert på prinsippet om agglutinasjon. Antistoffet identifiseres ved å teste det aktuelle plasma mot et panel av erytrocytter med kjent antigenstruktur.
Dersom pasienten er identifisert tidligere, og ikke har fått blod siden forrige identifisering, er det ikke nødvendig å identifisere før etter 2 år hvis funnene på antistoffscreeningen ikke gir mistanke om flere antistoffer.
Dersom pasienten har fått blod i mellomtiden, identifiserer vi hver 14. dag eller oftere dersom screeningsvaret tilsier at det har oppstått flere antistoffer.
Veileder for transfusjonstjenesten i Norge sier i kapittel 11.5.1 "Ny identifisering hos pasienter med tidligere påviste antistoffer bør i utgangspunktet gjøres hvis pasienten har blitt transfundert, eller vært gravid siden forrige identifisering".https://helsedirektoratet.no/retningslinjer/veileder-for-transfusjonstjenesten-i-norge

Vi velger å følge samme praksis som AIT, St. Olav.

REFERANSER

Hovedreferanse: (1) Firma BioRads produkt og arbeidsbeskrivelse. DiaMed-ID Micro Typing System IDCard Coombs IgG. Produkt-Id.:50540. Ref.nr.: 004024, 004025 og 004026.

ID-Card ”NaCl, enzyme test and cold agglutinins”. Produkt-ID.:50520, Ref.nr.:005014 og 005016.

Offisielle godkjenninger: (2) Produsenten BioRad oppgir å være sertifisert etter ISO 9001:2000 og EN ISO 13435:2000 og oppgir å praktisere GMP.(1) har IVD-merke på reagensene. Reagensene er CE-merket.

Nyttig litteratur: Veileder for transfusjonstjenesten i Norge, utgitt av Helsedirektoratet. utgave 7.3 2017. https://helsedirektoratet.no/retningslinjer/veileder-for-transfusjonstjenesten-i-norge

Immunologi og transfusjonslære - (Statens Helsetilsyn-1995 utgave)

Høring: Første versjon av prosedyren har vært til høring hos alle som er godkjent for å utføre analysen og hos medisinskfaglig rådgiver fra SOH.

INTERN KVALITETSKONTROLL

Hver gang vi mottar et nytt identifikasjonspanel og ved siste forbruksdag, blir disse satt opp mot kjente antistoffer, vi tester panelet ved alle tre teknikker. Se for øvrig
ALM-BB-L; Kontroll av screening- og identifiseringspanel og Dokumentet er ikke gyldig (Ikke tilgjengelig)

EKSTERN KVALITETSKONTROLL

Nasjonal kvalitetskontroll av immunhematologiske prosedyrer. Omfatter oftest både teoretiske og praktiske oppgaver. Arrangør: Ullevål universitetssykehus v/seksjon for Immunhematologi. Frekvens 2-3 ganger pr. år. Resultatet avleses på ID-Reader og lagres på server.

Equalis, svensk kvalitetskontroll som sendes ut ca. 10 ganger pr. år.

Forfatter:	Lene Johnsen Salberg (Overbioingeniør)
Godkjent av:	Birgit Johanne Hoel Stubbe (Seksjonsleder)
Dokumentadministrator:	Tove Elisabeth Berg Vordal (Fagansvarlig bioingeniør)
Dokument-ID:	4588
Gyldig fra:	04.01.2023
Revisjonsfrist:	03.01.2028

Arbeidsbeskrivelse

Hensikt

Omfang

Grunnlagsinformasjon

Revisjonskommentar

Relaterte dokumenter